發(fā)布時(shí)間：2020-09-19 19:51

　　 第一部分SM22α在結(jié)直腸癌中的表達(dá)目的:探討結(jié)直腸癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織中SM22α的mRNA和蛋白表達(dá)水平的差異,以及mRNA和蛋白表達(dá)的相關(guān)性,并將SM22α蛋白的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者的臨床病理參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。方法:應(yīng)用RT-qPCR檢測(cè)SM22α的mRNA表達(dá)水平,應(yīng)用Western blot檢測(cè)SM22α蛋白的表達(dá)水平,應(yīng)用Pearson Correlation Coefficients檢驗(yàn)分析SM22α的mRNA和蛋白表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果:RT-qPCR結(jié)果顯示,與對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織相比,結(jié)直腸癌組織中SM22α的mRNA表達(dá)水平明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001);Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織相比,結(jié)直腸癌組織中SM22α蛋白表達(dá)水平明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001);Pearson Correlation Coefficients檢驗(yàn)分析顯示,結(jié)直腸癌組織中SM22α的mRNA與蛋白表達(dá)一致(r=0.718,P0.01);78例結(jié)直腸癌患者中50(68.5%)例癌組織中SM22α蛋白表達(dá)低于其對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織,28(31.5%)例癌組織中SM22α蛋白表達(dá)與其對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織相比,無(wú)明顯差異或表達(dá)上調(diào),將癌組織中SM22α表達(dá)下調(diào)的50例患者定義為低表達(dá)組,癌組織中SM22α表達(dá)無(wú)差異或上調(diào)的28例患者定義為高表達(dá)組,SM22α蛋白表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者的腫瘤分化程度、性別、年齡、臨床分期、腫瘤部位、腫瘤浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)關(guān)(P0.05)。結(jié)論:結(jié)直腸癌組織中SM22α的mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào),且mRNA與蛋白表達(dá)水平一致,SM22α蛋白表達(dá)水平下調(diào)與結(jié)直腸癌患者的臨床病理參數(shù)無(wú)關(guān)。第二部分Sm22α基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化在結(jié)直腸癌中的作用目的:檢測(cè)結(jié)直腸癌組織和對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織中Sm22α基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài),以及甲基化對(duì)SM22α蛋白表達(dá)的影響,探討癌組織中Sm22α基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系。方法:應(yīng)用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(Methylation-specific PCR)技術(shù)分別檢測(cè)78例結(jié)直腸癌患者的癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織中Sm22α基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài),應(yīng)用χ2檢驗(yàn)分析對(duì)比兩組間Sm22α基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化差異與臨床病理參數(shù)的關(guān)系,應(yīng)用Kaplan-Meier法分析癌組織中SM22α甲基化與結(jié)直腸癌患者總體生存期的關(guān)系。結(jié)果:Methylation-specific PCR結(jié)果顯示,結(jié)直腸癌組織中有43例(59.0%)Sm22α基因啟動(dòng)子區(qū)呈甲基化狀態(tài),35例(41.0%)呈非甲基化狀態(tài),對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織中有19例(21.9%)Sm22α基因啟動(dòng)子區(qū)呈甲基化狀態(tài),59例(78.1%)呈非甲基化狀態(tài),結(jié)直腸癌組織中Sm22α基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平高于對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織(χ2=15.418,P0.001);Western blot(第一部分)和Methylation-specific PCR結(jié)果顯示,78例結(jié)直腸癌組織中SM22α蛋白表達(dá)下調(diào)且Sm22α基因啟動(dòng)子區(qū)呈甲基化狀態(tài)者40例,SM22α蛋白表達(dá)增高且Sm22α基因啟動(dòng)子區(qū)呈非甲基化狀態(tài)者25例,SM22α蛋白表達(dá)下調(diào)且Sm22α基因啟動(dòng)子區(qū)呈非甲基化者10例,SM22α蛋白表達(dá)增高且Sm22α基因啟動(dòng)子區(qū)呈甲基化狀態(tài)者3例,關(guān)聯(lián)性分析顯示,結(jié)直腸癌組織中Sm22α基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與SM22α蛋白表達(dá)負(fù)相關(guān)(r=-0.668,P0.001);癌組織中Sm22α基因啟動(dòng)子區(qū)非甲基化的結(jié)直腸癌患者和甲基化的患者術(shù)后隨訪3年總生存率分別為88.57%和67.44%,Sm22α基因啟動(dòng)子區(qū)非甲基化患者術(shù)后隨訪3年總生存率較甲基化患者升高(P0.05),Sm22α基因啟動(dòng)子區(qū)非甲基化的結(jié)直腸癌患者和甲基化的患者術(shù)后3年無(wú)復(fù)發(fā)生存率分別為80%和67.44%,Sm22α基因啟動(dòng)子區(qū)非甲基化患者術(shù)后隨訪3年無(wú)復(fù)發(fā)生存率較甲基化患者升高(P0.05);癌組織中Sm22α基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)關(guān)系的分層分析顯示,在結(jié)直腸癌組織中Sm22α基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與患者的性別、年齡、分化程度、臨床分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度和腫瘤部位均無(wú)關(guān)(P0.05)。結(jié)論:Sm22α基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平在結(jié)直腸癌組織中升高,并與其蛋白表達(dá)負(fù)相關(guān);癌組織中Sm22α基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化率與結(jié)直腸癌患者的不良預(yù)后有關(guān),但與臨床病理參數(shù)無(wú)關(guān)。第三部分沉默SM22α表達(dá)對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116生物學(xué)行為的影響目的:沉默SM22α表達(dá)對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116增殖能力、克隆形成能力、細(xì)胞周期及MMP-9表達(dá)的影響,經(jīng)5-Aza-2-Deoxycytidine處理去甲基化后SM22α的mRNA及蛋白表達(dá)情況。方法:應(yīng)用siRNA-SM22α轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116,RT-qPCR檢測(cè)Sm22α基因mRNA表達(dá)情況,Western blot檢測(cè)SM22α蛋白表達(dá)情況,沉默SM22α表達(dá)后MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HCT116細(xì)胞增殖活性、平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HCT116細(xì)胞克隆形成能力、流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)對(duì)HCT116細(xì)胞周期的影響,RT-qPCR檢測(cè)沉默Sm22α后MMP-9 mRNA的表達(dá)水平,Western blot檢測(cè)MMP-9蛋白表達(dá)水平,經(jīng)5-Aza-Dc處理人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116 Sm22α基因去甲基化后,RT-qPCR檢測(cè)Sm22α基因mRNA表達(dá)情況,Western blot檢測(cè)SM22α蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:siRNA-SM22α轉(zhuǎn)染48小時(shí)后RT-qPCR結(jié)果顯示,siRNA組較siRNA-NC和未轉(zhuǎn)染組Sm22α基因mRNA表達(dá)水平降低(P0.05),Western blot結(jié)果顯示,si RNA組較siRNA-NC和未轉(zhuǎn)染組SM22α蛋白表達(dá)水平降低(P0.05);MTS結(jié)果顯示,接種48小時(shí)、72小時(shí)和96小時(shí)后,人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116 siRNA組的OD值,分別較相應(yīng)時(shí)間的si RNA-NC組和未轉(zhuǎn)染組升高(P0.05),而siRNA-NC組的OD值和未轉(zhuǎn)染組相比,無(wú)明顯差異(P0.05);平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116細(xì)胞siRNA組克隆形成數(shù)較si RNA-NC和未轉(zhuǎn)染組相比明顯增加(P0.05),而siRNA-NC組的克隆形成數(shù)和未轉(zhuǎn)染組相比,無(wú)明顯差異(P0.05);流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示,沉默SM22α表達(dá)后si RNA組增殖指數(shù)與未轉(zhuǎn)染組相比升高(P0.05),而si RNA-NC組增殖指數(shù)和未轉(zhuǎn)染組相比無(wú)明顯差異(P0.05);RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示沉默SM22α表達(dá)后,與未轉(zhuǎn)染組相比,siRNA組MMP-9 mRNA的表達(dá)水平升高(P0.05),而siRNA-NC組和未轉(zhuǎn)染組相比無(wú)明顯差異(P0.05),Western blot結(jié)果顯示,與未轉(zhuǎn)染組相比,siRNA組MMP-9的蛋白表達(dá)水平升高(P0.05),而siRNA-NC組和未轉(zhuǎn)染組相比無(wú)明顯差異(P0.05);經(jīng)5-Aza-Dc處理Sm22α基因去甲基化后,RT-qPCR結(jié)果顯示去甲基化組細(xì)胞Sm22α基因mRNA表達(dá)水平較未處理組細(xì)胞升高(P0.05),Western blot檢測(cè)證實(shí)去甲基化組細(xì)胞SM22α蛋白表達(dá)水平較未處理組細(xì)胞升高(P0.05)。結(jié)論:沉默SM22α表達(dá)促進(jìn)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116的增殖活性、克隆形成能力及上調(diào)MMP-9表達(dá),Sm22α基因去甲基化后其mRNA和蛋白表達(dá)水平升高。結(jié)論:1.結(jié)直腸癌組織中SM22α的mRNA及蛋白表達(dá)水平下調(diào),且mRNA與蛋白表達(dá)水平一致;結(jié)直腸癌組織中SM22α蛋白表達(dá)下調(diào)與患者的臨床病理參數(shù)無(wú)關(guān)。2.Sm22α基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平在結(jié)直腸癌組織中升高,并與其蛋白表達(dá)成負(fù)相關(guān);結(jié)直腸癌組織中Sm22α基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化與患者的不良預(yù)后有關(guān),但與臨床病理參數(shù)無(wú)關(guān)。3.沉默SM22α表達(dá)促進(jìn)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116的增殖活性、克隆形成能力及上調(diào)MMP-9的表達(dá)水平;Sm22α基因去甲基化后其mRNA和蛋白表達(dá)水平升高。
【學(xué)位單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.34
【部分圖文】：

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20圖 1 RNA 電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis for RNAAB

圖 3 SM22α 在結(jié)直腸癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織中蛋白表達(dá) Expression of SM22α in colorectal cancer tissues (Ca) and adal tissues (N). A: Representative results of western blot analysent normal tissues. Ca, colorectal cancer tissues. B: Densitoing analysis for the blots; ***P<0.001 cancer tissues vs. normal tis

圖 3 SM22α 在結(jié)直腸癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織中蛋白表達(dá)ig.3 Expression of SM22α in colorectal cancer tissues (Ca) and adormal tissues (N). A: Representative results of western blot analysdjacent normal tissues. Ca, colorectal cancer tissues. B: Densitocanning analysis for the blots; ***P<0.001 cancer tissues vs. normal tis

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