放化療是惡性腫瘤的主要治療手段,吉西他濱是臨床上治療實體瘤和淋巴瘤的常用化療藥物,常常導致血小板減少,不但影響腫瘤治療,甚至可能發(fā)生危及生命的出血風險。目前吉西他濱及電離輻射對巨核細胞增殖、多倍體形成、分化成熟及血小板生成的影響及具體機制目前尚不完全清楚,闡明這一問題及機制,為減輕放化療導致血小板減少這一副作用具有重要意義。目的:探討化療藥物吉西他濱對巨核細胞的增殖、分化成熟及血小板生成這一過程的影響和作用機制,低劑量輻射對巨核細胞增殖、分化成熟及血小板生成的影響及對吉西他濱引起的血小板減少的保護作用。方法:1.吉西他濱對巨核細胞的增殖、分化及血小板生成的影響及機制研究體外研究:(1)通過WST-1實驗檢測吉西他濱作用后巨核細胞增殖抑制率的變化。(2)通過CD41-FITC/PI雙染、CD41-FITC/CD61-PE雙染、Annexin V-APC/PI雙染流式細胞術檢測吉西他濱作用后巨核細胞多倍體形成、巨核細胞分化指標(CD41+/CD61+)及凋亡率的變化情況。(3)應用活細胞工作站的活細胞微分干涉相差顯微鏡觀察吉西他濱作用后的巨核細胞產(chǎn)生前血小板的過程的影響,并制作視頻。應用光學顯微鏡觀察并計數(shù)吉西他濱作用后的正在產(chǎn)生前血小板的巨核細胞的數(shù)量的變化。(4)通過實時定量Real-time PCR(q PCR)方法檢測吉西他濱作用后轉錄因子GATA-1、NF-E2、Fli-1及細胞周期相關蛋白的基因p21、Cyclin D1、Cyclin E1的表達變化。(5)通過Western blot方法檢測吉西他濱作用后ERK1/2、p-ERK1/2、p-P38、P38、AKT、p-AKT和LC3表達的變化。體內研究:(1)小鼠眼眶靜脈取血法,應用小鼠五分類血球儀進行血細胞計數(shù),觀察吉西他濱處理后的小鼠血小板計數(shù)的變化情況并繪制曲線。(2)尾靜脈注射NHS-biotin標記血小板,眼眶靜脈取血后Streptavidin-PE/CD41-FITC標記血小板,流式細胞儀檢測吉西他濱處理后每日NHS-biotin標記的血小板所占比例,連續(xù)檢測5 d,繪制血小板壽命曲線。(3)小鼠眼眶靜脈取血后留取血清檢測TPO、SDF1、IL-1細胞因子水平,頸椎脫臼法處死小鼠,取小鼠肝臟1小塊,提取總RNA,檢測肝臟TPO m RNA水平,同時取小鼠骨髓,應用石蠟包埋及免疫組化方法觀察骨髓巨核細胞數(shù)量及形態(tài)變化。2.低劑量輻射對巨核細胞的增殖、分化及血小板生成及對吉西他濱引起的血小板減少的保護作用的研究(1)通過WST-1實驗檢測不同劑量X線輻照后巨核細胞增殖率的變化。(2)通過CD41-FITC/PI雙染、CD41-FITC/CD61-PE雙染流式細胞術檢測LDR作用后巨核細胞多倍體形成、巨核細胞分化指標(CD41+/CD61+)的變化。(3)應用活細胞工作站的活細胞微分干涉相差顯微鏡觀察LDR作用后的巨核細胞產(chǎn)生前血小板的過程的影響,并制作視頻。應用光學顯微鏡觀察并計數(shù)LDR作用后的正在產(chǎn)生前血小板的巨核細胞的數(shù)量的變化。(4)將6-8周SPF級雄性C57BL/6小鼠分為對照組、低劑量輻照組(100m Gy)、單純吉西他濱組(Gem 200 mg/kg),低劑量輻照后序貫吉西他濱組(提前24h 100 m Gy+Gem 200 mg/kg),小鼠眼眶靜脈取血法,應用小鼠五分類血球儀進行血細胞計數(shù),觀察小鼠血小板計數(shù)的變化情況并繪制曲線。結果:1.吉西他濱可抑制巨核細胞的增殖、多倍體形成及分化成熟,但無誘導凋亡WST-1法檢測巨核細胞的增殖活性,在劑量效應研究中,我們發(fā)現(xiàn):與對照組相比,0.1-1μM的吉西他濱能夠明顯抑制巨核細胞的增殖,呈劑量依賴性。在時間效應研究中,我們發(fā)現(xiàn):與對照組比較,吉西他濱作用后24-96 h細胞增殖抑制率明顯增加,呈時間依賴性,96 h細胞增殖抑制最明顯。流式細胞術檢測巨核細胞多倍體形成,結果發(fā)現(xiàn):與對照組相比,0.1μM和0.5μM吉西他濱均能抑制巨核細胞的多倍體形成,使16倍體、32倍體和64倍體的巨核細胞所占的比例減少,而4倍體和8倍體巨核細胞所占的比例增多;并且0.1μM和0.5μM吉西他濱組的平均倍體數(shù)也顯著減低。流式細胞術檢測巨核細胞CD41+/CD61+表達率,結果發(fā)現(xiàn):與對照組相比,0.1μM和0.5μM吉西他濱均能抑制巨核細胞的CD41+/CD61+的表達,0.5μM吉西他濱組的巨核細胞的CD41+/CD61+的表達率減低更為顯著。流式細胞術檢測巨核細胞凋亡率,結果發(fā)現(xiàn):對照組巨核細胞正常分化成熟過程中伴隨細胞凋亡的發(fā)生,0.1μM和0.5μM吉西他濱組的細胞凋亡率較對照組無明顯差異。2.吉西他濱可抑制巨核細胞生成前血小板和血小板釋放的過程應用活細胞工作站的活細胞微分干涉相差顯微鏡觀察巨核細胞產(chǎn)生前血小板的過程,并應用光學顯微鏡觀察并計數(shù)正在產(chǎn)生前血小板的巨核細胞的數(shù)量,結果發(fā)現(xiàn):與對照組相比,吉西他濱0.1μM組和0.5μM組的巨核細胞產(chǎn)生前血小板和血小板釋放均受到抑制。3.吉西他濱可抑制轉錄因子GATA-1、NF-E2、Fli-1的表達,促進細胞周期相關蛋白的基因p21、Cyclin D1、Cyclin E1的表達應用實時熒光定量PCR方法(q PCR)檢測GATA-1、NF-E2、Fli-1、p21、Cyclin D1、Cyclin E1基因表達的情況。結果發(fā)現(xiàn):與對照組相比,吉西他濱0.5μM組的轉錄因子GATA-1、NF-E2、Fli-1基因表達顯著減低,而細胞周期相關蛋白基因p21、Cyclin D1、Cyclin E1基因表達不同程度升高,0.1μM吉西他濱組也有此趨勢,但無統(tǒng)計學差異。4.吉西他濱作用后LC3、p-P38蛋白表達增加,p-AKT蛋白表達降低,而p-ERK1/2表達無明顯變化應用Western-blot法檢測p-ERK1/2、p-p38 MAPK、p-AKT、LC3的蛋白表達變化。結果發(fā)現(xiàn):與對照組相比,吉西他濱0.1μM和0.5μM組的p-p38、LC3蛋白表達升高,p-AKT蛋白表達降低,而p-ERK蛋白表達水平無明顯變化5.吉西他濱可誘導小鼠血小板減少,但血小板壽命不受影響小鼠分為溶劑對照組(生理鹽水組)和吉西他濱給藥組,每日連續(xù)監(jiān)測血小板,結果發(fā)現(xiàn):與對照相比,吉西他濱可明顯誘導小鼠血小板逐漸減少,大約給藥后第7-8 d降至最低,第10-11 d恢復近正常水平,第13-14 d反彈性升高,第16-17 d逐漸恢復至正常水平。應用流式細胞儀檢測和分析CD41+/Biotin+的血小板的比例,連續(xù)檢測5 d,根據(jù)CD41+/Biotin+的血小板衰減的比例計算出血小板的壽命。結果發(fā)現(xiàn):與對照組相比,吉西他濱雖然影響小鼠體內血小板計數(shù),但并不影響小鼠體內血小板的壽命,血小板壽命大約為5 d。6.吉西他濱作用后血小板數(shù)最低時,小鼠肝臟TPO m RNA水平降低,而血清中TPO、SDF1和IL-1水平升高,骨髓中巨核細胞數(shù)量減少,體積減小小鼠分為溶劑對照組(生理鹽水組)和吉西他濱給藥組,每日連續(xù)監(jiān)測血小板,待血小板降至最低時,處死小鼠,應用q PCR方法檢測小鼠肝臟TPO m RNA水平,Elisa方法檢測血清中TPO、SDF-1和IL-1水平,HE染色觀察并計數(shù)骨髓巨核細胞。結果發(fā)現(xiàn):與對照組相比,吉西他濱組小鼠肝臟TPO m RNA水平降低,而血清中TPO水平增高,血清SDF-1和IL-1水平升高;小鼠骨髓中巨核細胞數(shù)量減少、體積減小。7.LDR可促進巨核細胞增殖WST-1法檢測巨核細胞的增殖活性,在劑量效應研究中,結果顯示:與對照組相比,25-100 m Gy的X線可促進巨核細胞增殖,其中75 m Gy促進增殖的效應最為明顯;而當輻射劑量超過200 m Gy時,巨核細胞增殖受到顯著的抑制。在時間效應研究中,結果顯示:與對照組比較,低劑量輻照75 m Gy后24-96 h細胞增殖明顯增加,24 h細胞增殖最明顯,48-96 h增殖不再繼續(xù)增加。8.LDR可促進巨核細胞多倍體形成及分化成熟應用CD41-FITC/PI雙染流式細胞術檢測LDR對巨核細胞多倍體形成,結果發(fā)現(xiàn):與對照組相比,75 m Gy可促進巨核細胞的多倍體形成,使16倍體、32倍體的巨核細胞所占的比例增加,而2倍體、4倍體和8倍體巨核細胞所占的比例減少,平均倍體數(shù)增加。應用CD41-FITC/CD61-PE雙染流式細胞術檢測LDR對巨核細胞CD41+/CD61+表達率。結果發(fā)現(xiàn):與對照組相比,75 m Gy X線可促進巨核細胞的CD41+/CD61+的表達。9.LDR可促進巨核細胞生成前血小板及血小板釋放應用活細胞工作站的活細胞微分干涉相差顯微鏡觀察巨核細胞生成前血小板的動態(tài)過程同時應用普通光學顯微鏡觀察產(chǎn)生前血小板的巨核細胞并統(tǒng)計數(shù)量,結果發(fā)現(xiàn):與對照組相比,LDR2組(75 m Gy第0 h+75 m Gy第96 h)的巨核細胞生成前血小板和血小板釋放有所增加,而LDR1組(75 m Gy第0 h)組的巨核細胞前血小板生成及血小板釋放無影響。10.LDR可減輕化療藥物吉西他濱引起的血小板減少的程度將小鼠分為對照組、低劑量輻照組(100 m Gy)、單純吉西他濱組(Gem 200mg/kg),低劑量輻照后序貫吉西他濱組(提前24 h 100 m Gy+Gem 200 mg/kg),每日監(jiān)測各組血小板計數(shù)。結果發(fā)現(xiàn):與對照組比較,吉西他濱組的血小板減低程度最嚴重,低劑量輻照后序貫吉西他濱給藥組,血小板減低程度有所減輕,而低劑量輻照組與對照組血小板數(shù)無明顯差異。結論:1.吉西他濱可抑制巨核細胞增殖、分化成熟以及血小板生成和釋放,但不誘導凋亡;2.吉西他濱可抑制巨核細胞轉錄因子GATA-1、NF-E2和Fli-1的表達,促進細胞周期相關蛋白的基因p21、Cyclin D1、Cyclin E1的表達;3.吉西他濱作用后LC3、p-P38蛋白表達增加,p-AKT蛋白表達降低,而p-ERK1/2表達無明顯變化。4.吉西他濱可誘導小鼠血小板減少,但血小板壽命不受影響;5.吉西他濱作用后血小板數(shù)最低時,小鼠肝臟TPO m RNA水平降低,而血清中TPO、SDF-1和IL-1水平升高,骨髓中巨核細胞數(shù)量減少,體積減小;6.LDR可促進巨核細胞增殖、分化成熟、多倍體形成以及血小板生成和釋放;7.LDR可減輕化療藥物吉西他濱引起血小板減少的程度而發(fā)揮保護作用。
【學位單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R730.5;R558.2
【部分圖文】：

4圖 2.1 巨核細胞發(fā)育和血小板生成Figure 2.1 Megakaryocyte development and platelet production

巨核細胞的核內有絲分裂

圖 2.3 TPO 與巨核細胞發(fā)育Figure 2.3 TPO and megakaryocyte developmentTPO 是巨核細胞發(fā)育過程發(fā)揮最重要的作用的細胞因子，除此之外，還有

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 楊喜平;邵麗娟;;巨核細胞再生障礙血髓象及療效觀察1例[J];吉林醫(yī)學信息;2006年Z1期

2 謝璐茜;;各種貧血中巨核細胞變化的觀察[J];華夏醫(yī)學;2017年06期

3 朱琳;安利;毛敏;宋靜雯;任雪瑞;王曉敏;仝鳳娟;;巨核細胞在骨髓增生異常綜合征中的臨床價值[J];血栓與止血學;2017年03期

4 王穎;董樹旭;趙軾軒;茹永新;;巨核細胞發(fā)育和血小板形成的形態(tài)結構[J];中國冶金工業(yè)醫(yī)學雜志;2015年01期

5 李紅衛(wèi);李建蘭;;小巨核細胞在骨髓增生異常綜合征中的診斷意義[J];臨床醫(yī)藥實踐;2014年05期

6 浦杰;陶英;楊梅如;;骨髓增生異常綜合征外周血循環(huán)微巨核細胞糖蛋白Ⅱb/Ⅲa的表達及其臨床意義[J];診斷學理論與實踐;2012年01期

7 俞騰;楊晶;;巨核細胞減少型難治性免疫性血小板減少性紫癜1例臨床分析[J];臨床血液學雜志;2012年03期

8 李萍;陳建蘭;顏金花;張華;;骨髓活檢小巨核細胞酶標染色對骨髓增生異常綜合征的診斷價值[J];中國實用醫(yī)藥;2012年31期

9 胡文廣;艾丹梅;;獲得性低巨核細胞血小板減少性紫癜26例臨床分析[J];醫(yī)學信息(上旬刊);2011年02期

10 李加平;;特發(fā)性血小板減少性紫癜中骨髓巨核細胞成熟障礙的探討[J];檢驗醫(yī)學與臨床;2010年03期

相關會議論文 前10條

1 李建蘭;馬瑞林;楊波;;小巨核細胞在骨髓增生異常綜合征中的診斷意義[A];第十一屆山西省血液病學術年會暨國家級及山西省繼續(xù)醫(yī)學教育學習班資料匯編[C];2010年

2 謝炳壽;周奇;董宏偉;胡理明;;獲得性無巨核細胞性血小板減少性紫癜(附1例報告)[A];2005年華東六省一市血液病學學術會議暨浙江省血液病學學術年會論文匯編[C];2005年

3 牛挺;廖小梅;趙鴻鷹;孟文彤;鄧承祺;;巨核細胞生成的負向調節(jié)因子血小板第4因子和轉化生長因子-β1在慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜發(fā)病中的意義[A];第十一屆全國血栓與止血學術會議暨血栓栓塞性疾�。ㄑㄅc止血）基礎與臨床研究進展學習班論文摘要匯編及學習班講義[C];2007年

4 許景艷;歐陽建;孫雪梅;范洵楠;陳軍浩;方義才;張鶴云;;巨核細胞生長因子對實驗性血小板減少小鼠的外周血小板的影響[A];2005年華東六省一市血液病學學術會議暨浙江省血液病學學術年會論文匯編[C];2005年

5 戴兵;何吉;陳舒;劉晉輝;秦斐;朱發(fā)明;嚴力行;;一氧化氮誘導臍帶血CD34~+細胞來源的巨核細胞產(chǎn)生血小板的研究[A];中國輸血協(xié)會第四屆輸血大會論文集[C];2006年

6 王海蓮;鞠秀麗;李棟;候懷水;時慶;;臍血CD34~+細胞向巨核細胞的分化擴增及基因表達的變化[A];第11次中國實驗血液學會議論文匯編[C];2007年

7 王紅美;沈柏均;時慶;侯懷水;;細胞因子對兒童ITP巨核細胞生成的調控[A];山東免疫學會、山東微生物學會醫(yī)學微生物學專業(yè)委員會、山東省醫(yī)學會微生物學和免疫學專業(yè)委員會、山東省醫(yī)藥生物技術學會2001年學術年會論文匯編[C];2001年

8 蔡海波;譚文松;張嗣良;;體外誘導巨核細胞生成的細胞因子組合優(yōu)化[A];第一屆全國化學工程與生物化工年會論文摘要集(下)[C];2004年

9 王欣;王文富;康利根;;誘導巨核細胞成熟治療復發(fā)性ITP療效觀察[A];2005年華東六省一市血液病學學術會議暨浙江省血液病學學術年會論文匯編[C];2005年

10 張磊;趙輝;劉斌;盧士紅;孫愛紅;馮義;湯峰武;楊仁池;韓忠朝;;原發(fā)性血小板增多癥中抗凋亡蛋白Bcl-x_L早期下調導致其巨核細胞過早分化成熟[A];中華醫(yī)學會第八次全國血液學學術會議論文匯編[C];2004年

相關重要報紙文章 前7條

1 陶春祥;TPO診斷治療血小板疾病的研究進展[N];中國醫(yī)藥報;2003年

2 光聞;血小板減少癥新戰(zhàn)略[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2005年

3 記者 錢錚;日本用人類iPS細胞首次制成血小板[N];新華每日電訊;2009年

4 記者 王小龍;日找到人工培育血小板的新方法[N];科技日報;2014年

5 劉道安;干細胞領域三個研究方向[N];健康報;2006年

6 舒華;血小板在人體中有何作用[N];醫(yī)藥養(yǎng)生保健報;2004年

7 武漢市第四醫(yī)院副主任醫(yī)師 王丹;血小板減少癥的防治[N];湖北日報;2000年

相關博士學位論文 前10條

1 樊紅瓊;吉西他濱及低劑量輻射對巨核細胞發(fā)育和血小板生成的影響及機制研究[D];吉林大學;2018年

2 關欣;巨核細胞的體外大規(guī)模生產(chǎn)及臨床前安全性和有效性研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2018年

3 金奇;STAT1與FAXDC2在巨核細胞生成中的功能和機制研究[D];武漢大學;2016年

4 劉占術;自噬抑制ITP患者巨核細胞凋亡的作用及其機制研究[D];重慶醫(yī)科大學;2018年

5 王琦;自噬紊亂對巨核細胞發(fā)育的影響和機制的研究[D];蘇州大學;2016年

6 馬東初;CD226分子表達于造血干/祖細胞和巨核細胞譜系及神經(jīng)細胞譜系參與巨核細胞倍體化調控[D];第四軍醫(yī)大學;2005年

7 張峰;ITP患者CTL/NK介導的血小板殺傷機制[D];山東大學;2005年

8 李啟明;巨核細胞與中性粒細胞相互作用機制及促巨核系生成的研究[D];第三軍醫(yī)大學;2006年

9 張磊;抗凋亡蛋白Bcl-x_L在巨核細胞分化中的作用及其在原發(fā)性血小板增多癥巨核細胞分化中表達的研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2004年

10 王琳;慢性ITP患者血漿對體外巨核細胞生長發(fā)育和血小板形成的影響及機制探討[D];山東大學;2006年

相關碩士學位論文 前10條

1 王章飛;Tumstatin轉基因巨核細胞聯(lián)合吉西他濱抑制小鼠肺腺癌移植瘤生長的實驗研究[D];安徽醫(yī)科大學;2018年

2 鄒曉靜;小分子化合物調節(jié)多種細胞周期蛋白促進巨核細胞的多倍體化[D];南方醫(yī)科大學;2017年

3 顏呈呈;出現(xiàn)異常巨核細胞的獲得性再生障礙性貧血患者臨床特征及轉歸分析[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2017年

4 梁志鵬;巨核細胞異形性改變在骨髓增殖性腫瘤繼發(fā)骨髓纖維化的臨床相關性研究[D];山西醫(yī)科大學;2013年

5 王琦;自噬參與巨核細胞成熟與前血小板釋放的初步研究[D];蘇州大學;2013年

6 邢學仰;23例獲得性低巨核細胞性血小板減少性紫癜的臨床分析[D];汕頭大學;2010年

7 馮斂;從臍血單個核細胞誘導巨核細胞體外擴增及分化的實驗研究[D];福建醫(yī)科大學;2005年

8 黃曼;造血干細胞移植后血小板減少相關機制及干預研究[D];蘇州大學;2016年

9 王婭;ITP血漿對巨核細胞生成影響機制的研究[D];南方醫(yī)科大學;2012年

10 杜偉;骨髓增生異常綜合征與特發(fā)性血小板減少性紫癜骨髓巨核細胞的觀察[D];新疆醫(yī)科大學;2014年

本文編號：2821836