乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤。以CTLA-4為靶點(diǎn)的免疫治療是極具前景的抗腫瘤治療方案，利用CTLA-4抗體（a-CTLA-4）能夠促進(jìn)T細(xì)胞重新活化、增殖，提高機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答。本課題組前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，單獨(dú)使用a-CTLA-4治療乳腺癌效果并不理想。近年來(lái)，越來(lái)越多研究顯示腫瘤微環(huán)境（TME）成為腫瘤免疫逃逸以及調(diào)控腫瘤對(duì)抗癌藥物敏感性的關(guān)鍵因素，以TME為靶點(diǎn)的治療學(xué)研究為惡性腫瘤的治療帶來(lái)了新的希望�；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）能夠作用于TME內(nèi)多種成分，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。因此，本課題組擬應(yīng)用MMPs抑制劑（MMPI）抑制MMPs活性以期改善腫瘤微環(huán)境，提高a-CTLA-4治療效果。 本實(shí)驗(yàn)使用小鼠乳腺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系4T1，皮下接種于雌性BALB/c小鼠右后背部，構(gòu)建乳腺癌模型，荷瘤小鼠分成四組：vehicle組、a-CTLA-4組、MMPI組及a-CTLA-4+MMPI組，接種后第3天開(kāi)始給藥至第42天。應(yīng)用游標(biāo)卡尺和小動(dòng)物超聲監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)；治療結(jié)束后應(yīng)用波恩氏固定液固定肺組織后觀察并計(jì)數(shù)肺表面轉(zhuǎn)移灶，同時(shí)顯微鏡下計(jì)數(shù)肝臟和肺臟轉(zhuǎn)移灶數(shù)目；采用生化分析儀檢測(cè)小鼠的肝腎功能；采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)小鼠脾臟內(nèi)免疫細(xì)胞亞型包括CD4+T、CD8+T細(xì)胞、髓源性抑制細(xì)胞（MDSCs）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）以及骨髓內(nèi)MDSCs進(jìn)行檢測(cè)；應(yīng)用免疫熒光法檢測(cè)腫瘤組織內(nèi)上述免疫細(xì)胞亞型的浸潤(rùn)；應(yīng)用免疫組化檢測(cè)腫瘤組織內(nèi)微血管密度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 一、MMPs抑制劑對(duì)CTLA-4抗體治療小鼠乳腺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響 1.荷瘤小鼠乳腺癌生長(zhǎng)情況：與vehicle組比較，單用a-CTLA-4、單用MMPI及a-CTLA-4+MMPI對(duì)小鼠移植瘤的生長(zhǎng)均具有不同程度的抑制作用。其中a-CTLA-4+MMPI組與vehicle組及MMPI組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；而單用a-CTLA-4及MMPI與vehicle比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 2.荷瘤小鼠乳腺癌轉(zhuǎn)移情況：肉眼觀察各組小鼠肺組織都有大小數(shù)量不等的腫瘤轉(zhuǎn)移灶。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，a-CTLA-4+MMPI組與vehicle組比較，荷瘤小鼠肺表面轉(zhuǎn)移灶數(shù)目明顯減少（P0.05）；而單用a-CTLA-4及單用MMPI與vehicle比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)肝臟和肺臟轉(zhuǎn)移灶數(shù)目。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，a-CTLA-4+MMPI與vehicle比較，肝臟及肺臟轉(zhuǎn)移灶數(shù)目明顯減少（P0.001）；而單用a-CTLA-4與vehicle比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。 3.小鼠肝腎功能檢測(cè)：荷瘤小鼠肝腎功能指標(biāo)與正常小鼠比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 二、MMPs抑制劑對(duì)CTLA-4抗體治療小鼠乳腺癌免疫學(xué)指標(biāo)的影響 1.免疫效應(yīng)細(xì)胞CD4+T和CD8+T細(xì)胞以及兩者的比值：與vehicle組及單獨(dú)給藥組比較，a-CTLA-4+MMPI組內(nèi)荷瘤小鼠脾臟內(nèi)CD4+T和CD8+T細(xì)胞百分比無(wú)明顯改變。與vehicle組比較，單給藥組及a-CTLA-4+MMPI組內(nèi)荷瘤小鼠脾臟中CD8+T/CD4+T都有所提高，其中MMPI組與vehicle組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。 2.免疫抑制細(xì)胞MDSCs、Treg細(xì)胞和免疫抑制相關(guān)細(xì)胞Th17以及Treg/Th17：a-CTLA-4組與vehicle組比較，荷瘤小鼠脾臟內(nèi)Treg細(xì)胞、MDSCs和骨髓內(nèi)MDSCs百分比以及Treg/Th17有所下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），但是a-CTLA-4+MMPI組與vehicle組比較前述指標(biāo)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。a-CTLA-4+MMPI組與vehicle組比較Th17有所下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 三、MMPs抑制劑對(duì)CTLA-4抗體治療小鼠乳腺癌腫瘤微環(huán)境的影響 1.免疫效應(yīng)細(xì)胞CD4+T和CD8+T細(xì)胞以及兩者的比值：與vehicle組和a-CTLA-4組比較，a-CTLA-4+MMPI組腫瘤組織內(nèi)浸潤(rùn)的CD4+T、CD8+T細(xì)胞百分比增多，CD8+T/CD4+T有所提高。其中，a-CTLA-4+MMPI組與a-CTLA-4組比較，CD8+T/CD4+T有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。2.免疫抑制細(xì)胞Treg細(xì)胞、MDSCs和相關(guān)細(xì)胞Th17以及Treg/Th17：與vehicle組比較，a-CTLA-4+MMPI組內(nèi)荷瘤小鼠腫瘤組織中MDSCs、Th17及Treg細(xì)胞百分比下降明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。與vehicle組比較，a-CTLA-4+MMPI組及單用藥組內(nèi)荷瘤小鼠腫瘤組織中Treg/Th17略有下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05） 3.腫瘤間質(zhì)內(nèi)微血管密度：與vehicle組比較，單獨(dú)使用a-CTLA-4荷瘤小鼠腫瘤組織內(nèi)MVD值有所下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；而a-CTLA-4+MMPI組與vehicle組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）；a-CTLA-4+MMPI組與MMPI組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 4.腫瘤間質(zhì)內(nèi)微血管密度與免疫細(xì)胞相關(guān)性分析：Spearman相關(guān)性分析顯示，腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)C(jī)D8+T和CD4+T細(xì)胞百分比以及CD8+T/CD4+T與MVD呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.800、-0.800以及-0.100，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。荷瘤小鼠腫瘤組織內(nèi)Treg細(xì)胞、Th17和MDSCs百分比以及Treg/Th17與MVD呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.400、0.800、0.800以及0.400。其中，MDSCs與MVD相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 結(jié)論： 1. MMPs抑制劑提高了CTLA-4抗體對(duì)小鼠乳腺癌的治療效果，包括抑制腫瘤的生長(zhǎng)和減少轉(zhuǎn)移灶的形成。 2.與單獨(dú)使用CTLA-4抗體治療小鼠乳腺癌比較，聯(lián)合CTLA-4抗體及MMPs抑制劑，荷瘤小鼠脾臟內(nèi)免疫抑制細(xì)胞MDSCs和Treg細(xì)胞百分比顯著下降，免疫效應(yīng)細(xì)胞CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞百分比以及CD8+T細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞比值均有所增加。 3.與單獨(dú)使用CTLA-4抗體治療小鼠乳腺癌比較，聯(lián)合CTLA-4抗體及MMPs抑制劑明顯抑制了腫瘤微環(huán)境內(nèi)MDSCs、Th17以及Treg細(xì)胞的浸潤(rùn)；顯著降低了腫瘤微環(huán)境內(nèi)微血管密度。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R737.9
【部分圖文】：

3.1.1 荷瘤小鼠乳腺癌生長(zhǎng)情況監(jiān)測(cè)為方便監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)情況，此次實(shí)驗(yàn)采用皮下接種的方法構(gòu)建乳腺癌模型文獻(xiàn)報(bào)道，4T1 細(xì)胞按 1×106/只接種后 42 天是觀察腫瘤轉(zhuǎn)移的最佳時(shí)機(jī)[41]。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 4T1 于接種第 3 天成瘤，因此，此次藥物治療周期選擇第 3 天到第 42 天。于接種 4T1 后每隔 3 天應(yīng)用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤長(zhǎng)徑和短徑，計(jì)算腫瘤體積并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，采用小動(dòng)物超聲于接種第 7、21、35 天監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，單用 a-CTLA-4、單用 MMPI 及 a-CTLA-4MMPI 對(duì)小鼠移植瘤的生長(zhǎng)均具有不同程度的抑制作用。其中 a-CTLA-4+ MMP與vehicle及MMPI組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；單用a-CTLA-4及MMP與 vehicle 比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖 3.1，圖 3.2）。

15圖 3.2 小動(dòng)物超聲監(jiān)測(cè)乳腺癌生長(zhǎng)A. vehicle B.MMPI C.a-CTLA-4 D. a-CTLA-4+ MMPI3.1.2 荷瘤小鼠乳腺癌轉(zhuǎn)移情況檢測(cè)為確認(rèn)移植瘤小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移灶分布情況，分別取各組小鼠肺臟，用波恩氏固定液固定 48h，取肺臟組織和經(jīng) 10%福爾馬林固定的肝臟，制成石蠟切片后進(jìn)行 HE 染色，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道方法計(jì)數(shù)肺臟表面及顯微鏡下肺臟和肝臟組織內(nèi)

第 3 章 結(jié)果[42]。結(jié)果顯示：各組肺臟表面均可見(jiàn)大小數(shù)量不等的淡黃色結(jié)節(jié)(圖 3.3)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明：a-CTLA-4 +MMPI 與 vehicle 比較，肺臟目明顯減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而單用 a-CTLA-4 及單用cle 比較均無(wú)顯著性意義（P>0.05）(圖 3.4)。顯微鏡下觀察各組小組織內(nèi)均可見(jiàn)不同數(shù)量和大小的轉(zhuǎn)移灶形成。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析-4 +MMPI 與 vehicle 比較，肝臟及肺臟內(nèi)轉(zhuǎn)移灶數(shù)目明001）；而單用 a-CTLA-4 與 vehicle 比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0 3.6，圖 3.7，圖 3.8）。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 拉宗;王建霞;崔倪;李明月;邢樹剛;任博;張麗紅;李偉;李玉林;;乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌微環(huán)境中CD4和CD8陽(yáng)性T細(xì)胞表達(dá)與血管新生的關(guān)聯(lián)性分析[J];吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2014年05期

2 HUANG Bo;;Tumor microenvironment:a mechanical force link[J];Science China(Life Sciences);2015年02期

本文編號(hào)：2821291