目的:內(nèi)源性或獲得性化療耐藥已成為人類攻克腫瘤的一大障礙。然而僅有7%-16%的雌激素受體(estrogen receptor,ER)陽性乳腺癌患者在接受新輔助化療后可以達(dá)到pCR。Nogo-B受體(NgBR)是一種細(xì)胞膜蛋白受體,其可以與法尼基化的原癌基因RAS結(jié)合并促使RAS遷移至細(xì)胞膜。本實(shí)驗(yàn)的目的在于檢測(cè)NgBR的表達(dá)量是否會(huì)影響ER陽性乳腺癌細(xì)胞接受紫杉醇(paclitaxel,PTX)的治療療效,在此過程中NgBR在ERα介導(dǎo)的信號(hào)通路發(fā)揮的作用,并深入地探討NgBR在紫杉醇耐藥過程中的分子機(jī)制。方法:1.應(yīng)用免疫組化(Immunohistochemistry,IHC)技術(shù)對(duì)38名ER陽性乳腺癌患者新輔助前的腫物穿刺組織切片和新輔助化療后的乳腺殘留癌組織切片進(jìn)行NgBR和Nogo-B染色,結(jié)合其病理結(jié)果和NgBR、Nogo-B的表達(dá)量分析兩者相關(guān)性。2.在體外實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)NgBR在雌激素(Estradiol,E2),PTX治療及兩者聯(lián)合作用對(duì)人乳腺癌T47D/MCF-7細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,包括:CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性;集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞形成集落的能力;AO/EB雙熒光染色法和Annexin V-FITC/propidium iodide(PI)染色聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。3.人乳腺癌細(xì)胞T47D細(xì)胞經(jīng)NgBR敲降處理后,加以E2刺激,應(yīng)用Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白(p53,survivin)和相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路(如phos-Akt,phos-ERK,phos-ERα)的表達(dá)水平。4.乳腺癌細(xì)胞T47D和MCF-7經(jīng)NgBR敲降處理后,加以E2刺激,應(yīng)用染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)技術(shù)檢測(cè) ERα與 ERα靶基因上的雌激素應(yīng)答元件(estrogen-responsive element,ERE)結(jié)合及p53與survivin 啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合的變化。5.在體外實(shí)驗(yàn)中,檢測(cè)NgBR在表皮生長因子(Epidermal Growth Factor,EGF),PTX治療及兩者聯(lián)合作用是對(duì)人乳腺癌T47D細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,包括:CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性;集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞形成集落的能力;AO/EB雙熒光染色法和Annexin V-FITC/PI染色聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。6.乳腺癌細(xì)胞T47D細(xì)胞經(jīng)NgBR敲降處理后,加以EGF刺激,應(yīng)用Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞中survivin和相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路(如phos-Akt,phos-ERK,phos-ERα)的表達(dá)水平。7.乳腺癌細(xì)胞T47D細(xì)胞經(jīng)E2或EGF刺激后,應(yīng)用Real time RT-PCR技術(shù),檢測(cè)NgBR和survivin mRNA表達(dá)水平的變化。結(jié)果:在此文章中,我們證明了 NgBR可以作為一種潛在的靶標(biāo)用來削弱雌激素受體α陽性乳腺癌的紫杉醇耐化療效果。首先,通過分析臨床ER陽性乳腺癌患者新輔助化療前后的病理切片結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)84%的患者對(duì)新輔助化療并沒有應(yīng)答或僅產(chǎn)生部分應(yīng)答。在這部分患者中,近74%在接受新輔助化療前具有高表達(dá)的NgBR水平,經(jīng)過新輔助化療后,其中58%患者的殘留乳腺癌中NgBR表達(dá)量進(jìn)一步增高。利用基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫內(nèi)的信息和Kaplan-Meier分析,我們發(fā)現(xiàn)高表達(dá)NgBR mRNA(NUS1)的ER陽性,Her-2陰性乳腺癌患者無復(fù)發(fā)生存率(Recurrence Free Survival,RFS)明顯降低。在此基礎(chǔ)上,我們利用人乳腺癌細(xì)胞T47D和MCF-7證明了在ER陽性乳腺癌細(xì)胞中敲降NgBR,可明顯抵抗由E2或EGF誘導(dǎo)的促細(xì)胞增殖作用,降低細(xì)胞活性與集落形成能力;協(xié)助PTX抵抗E2或EGF導(dǎo)致的腫瘤耐藥,使細(xì)胞對(duì)PTX的細(xì)胞毒性作用重獲敏感性,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。為了進(jìn)一步研究NgBR增加ERα陽性乳腺癌紫杉醇耐藥性的分子機(jī)制,我們利用Western Blot技術(shù)檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路和蛋白的表達(dá),結(jié)果表明敲降NgBR后通過下調(diào)其介導(dǎo)的PI3K/AKT和MAPK/ERK通路調(diào)節(jié)p53和survivin的表達(dá)從而增強(qiáng)紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。NgBR敲降可分別削弱E2或EGF刺激所誘導(dǎo)的ERα磷酸化。Real time RT-PCR技術(shù)結(jié)果證明,E2或EGF刺激可上調(diào)ERα陽性乳腺癌細(xì)胞T47D內(nèi)NgBR和survivin的蛋白和mRNA表達(dá)水平。最后,利用ChIP-PCR實(shí)驗(yàn)我們?cè)诜肿铀缴线M(jìn)一步證實(shí)了,敲降NgBR后,減少了 ERα與ERα靶基因上的雌激素應(yīng)答元件結(jié)合,并通過增強(qiáng)p53在survivin啟動(dòng)子區(qū)的富集而下調(diào)survivin的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)論:在此項(xiàng)研究中我們發(fā)現(xiàn),NgBR在ER陽性乳腺癌患者新輔助化療后的殘留乳腺癌中呈高表達(dá)狀態(tài)。敲降NgBR后可上調(diào)p53(腫瘤抑制因子)的表達(dá)水平,抑制survivin的蛋白表達(dá),此過程通過下調(diào)Akt和ERK的磷酸化實(shí)現(xiàn)。同時(shí)在分子水平上我們發(fā)現(xiàn),NgBR敲降可增強(qiáng)p53結(jié)合至survivin的啟動(dòng)子區(qū),從而抑制survivin的表達(dá)。此外,敲降NgBR可明顯削弱E2或EGF誘導(dǎo)的紫杉醇耐藥。敲降NgBR可通過下調(diào)EGF誘導(dǎo)的Akt、ERK、ERα磷酸化和survivin的表達(dá)。我們的實(shí)驗(yàn)闡明了 NgBR在ERα陽性乳腺癌紫杉醇獲得性耐藥中發(fā)揮了的重要作用。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R737.9
【部分圖文】：

圖 1.1 Nogo-B, NgBR 和 PECAM-1 在新生血管的定位（箭頭所示）。Figure 1.1 Localization of Nogo-B, NgBR, and PECAM-1 in angiogenic blood vessels (arrows)[21].Baofeng 及其同事利用斑馬魚模型系統(tǒng)進(jìn)一步闡述了 NgBR 和 Nogo-B 如何

圖 1.2 敲降 NgBR 和 Nogo-B 對(duì)斑馬魚節(jié)間血管形成期的影響。NgBR 敲降阻斷節(jié)間血管的形成。Figure 1.2 Effects of zNgBR and zNogo-B MO-injection on ISV formation. zNgBRMO blocks ISV formation[28].

NgBR 調(diào)節(jié)內(nèi)皮氮氧合酶偶聯(lián) Akt 信號(hào)通路，敲降 NgBROS 和磷酸化 Akt 的基礎(chǔ)水平以及被 VEGF 激活后的表達(dá)ure 1.3 NgBR modulates eNOS coupling through Akt pathwn in control PAECs decreased the basal phosphorylation of eNs well as VEGF-stimulated phosphorylation of eNOS and Akt

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本文編號(hào)：2821309