目的:胃癌在全世界范圍內(nèi)是發(fā)病率最高的癌癥之一,我國的胃癌發(fā)病率高、轉(zhuǎn)移率高、死亡率高和早診率低、根治切除率低、5年生存率低等特點(diǎn)。進(jìn)展期胃癌的治療是我們面臨的巨大挑戰(zhàn)。小白菊內(nèi)酯(Parthenolide,PTL)是分離自艾菊、篙屬、觀光木、歐洲小白菊等藥用植物,具有抗炎、抗病毒、氧化應(yīng)激、誘導(dǎo)凋亡、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等作用。對于來自血液、腸道、肝臟,乳腺,前列腺,血液等的多種腫瘤細(xì)胞的增殖有抑制效應(yīng)。小白菊內(nèi)酯可通過抑制NF-κB信號通路,發(fā)揮其抗腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移、藥物抗性等作用,且PTL基本不損傷正常細(xì)胞,故PTL在將來腫瘤治療中具有重大意義,但目前,PTL對胃癌的抗腫瘤及化療耐藥等研究方面較少,為了探討PTL在逆轉(zhuǎn)胃癌化療耐藥中的作用,我們通過研究PTL對胃癌細(xì)胞SGC7901對順鉑(DDP)的敏感性的影響;以及胃癌耐藥細(xì)胞株SGC7901/DDP、SGC7901/ADR耐藥性的影響,并通過對P-gp、MRP、Bcl-2、Cyclin D1、NF-κB、Caspase-8表達(dá)及活性檢測,探討PTL是否可增加胃癌細(xì)胞對順鉑的敏感性,以及逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥細(xì)胞多藥耐藥的作用及其機(jī)制。研究方法:本研究利用MTT法檢測PTL、DDP、ADR單獨(dú)及聯(lián)合對胃癌細(xì)胞的增殖抑制率的影響,培養(yǎng)胃癌細(xì)胞株SGC7901、SGC7901/DDP、SGC7901/ADR細(xì)胞株,加入96孔板,實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的PTL、DDP、ADR、PTL+DDP、PTL+ADR,對照組則加等量培養(yǎng)液,干預(yù)48小時(shí)后,檢測吸光度(OD)值并計(jì)算增殖抑制率。并用流式細(xì)胞儀檢測PTL、DDP、ADR單獨(dú)及聯(lián)合對胃癌細(xì)胞的凋亡的影響,消化收集PTL、DDP、ADR、PTL+DDP、PTL+ADR處理48h的SGC7901、SGC7901/DDP、SGC7901/ADR細(xì)胞,AnnexinV-FITC/PI染色后,流式細(xì)胞儀檢測,分析細(xì)胞凋亡百分比。采用體外逐步增加順鉑藥物濃度反復(fù)間歇誘導(dǎo)法,建立胃癌順鉑耐藥株SGC7901/DDP。并采用MTT法測定SGC7901/DDP、SGC7901/ADR對各種化療藥物的耐藥指數(shù),觀察凍存、撤藥對SGC7901/DDP耐藥性的影響。Western blot方法檢測P-gp、MRP、Bcl-2、CyclinD1蛋白的表達(dá)。收集對照組、PTL、DDP、PTL+DDP處理48h的SGC7901細(xì)胞蛋白,用Western blot方法檢測Bcl-2蛋白的表達(dá)。收集不同濃度PTL處理48h的SGC7901/DDP、SGC7901/ADR細(xì)胞蛋白,以未處理的SGC7901細(xì)胞蛋白為對照組,檢測P-gp、MRP、Bcl-2、CyclinD1蛋白的表達(dá)。EMSA檢測NF-κB活性,收集對照組、PTL、DDP、PTL+DDP處理48h的SGC7901細(xì)胞蛋白,電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)檢測NF-κB DNA-蛋白結(jié)合活性。收集不同濃度PTL處理48h的SGC7901/DDP、SGC7901/ADR細(xì)胞,以未處理的SGC7901細(xì)胞為對照組,電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)檢測NF-κB DNA-蛋白結(jié)合活性。分光光度法檢測Caspase-8的活性,收集對照組、PTL、DDP、PTL+DDP處理24h、48h的SGC7901細(xì)胞,分光光度法檢測Caspase-8的活性。本研究結(jié)果均以mean士SD表示,應(yīng)用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較。方差分析進(jìn)行多組間比較采用,應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果:PTL對SGC7901細(xì)胞有增殖抑制作用,小劑量PTL可增加DDP的藥物敏感性。小白菊內(nèi)酯和順鉑抑制SGC7901細(xì)胞作用呈濃度依賴關(guān)系,PTLIC50為17.4±1.04μmol/L,DDPIC50為2.61±0.26mg/L,PTL10μmol/L與DDP聯(lián)用時(shí)對SGC7901細(xì)胞的增順殖抑制率顯著高于鉑單獨(dú)用藥,顯著降低DDP的半數(shù)抑制濃度,IC50為0.86±0.07mg/L。PTL可誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞凋亡,PTL與DDP合用可顯著增加DDP誘導(dǎo)凋亡作用。與對照組凋亡率(10.65%±2.12%)比較,10μmol/L PTL及2mg/LDDP誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞凋亡增加20.16%±2.22%(P0.05)、26.14%±3.03%(P0.05),聯(lián)合應(yīng)用時(shí)凋亡率顯著增加67.14%±5.52%(P0.01)。PTL可通過抑制NF-κB激活,抑制Bcl-2的表達(dá),上調(diào)Caspase-8的活性,抑制SGC7901細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡。并通過抑制DDP誘導(dǎo)的NF-κB激活,抑制Bcl-2的表達(dá),上調(diào)Caspase-8的活性,增加DDP對胃癌細(xì)胞的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡能力。對照組、PTL、DDP、PTL+DDP四組細(xì)胞的NF-κB、Caspase-8的活性,Bcl-2的表達(dá)進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示,與對照組比較,DDP組的NF-κB活性顯著增加(P0.01),Bcl-2的表達(dá)及Caspase-8的活性無顯著差異(P0.05);PTL組NF-κB、Caspase-8的活性顯著降低(P0.01),Bcl-2的表達(dá)下調(diào)(P0.01);PTL+DDP組與對照組及DDP組比較NF-κB、Caspase-8的活性顯著降低(P0.01),Bcl-2的表達(dá)顯著下調(diào)(P0.01)。建立SGC7901/DDP耐藥細(xì)胞株,SGC7901/DDP耐藥指數(shù)為13.46,加藥-196℃凍存4mo復(fù)蘇后其RI仍維持凍存前水平,耐藥可持續(xù)性的研究表明在脫藥細(xì)胞傳代培養(yǎng)情況下,細(xì)胞自第8代耐藥性開始顯著下降。SGC7901/DDP具有多藥耐藥性,各類臨床常用化療代表藥物ADR、DNR、MMC、VCR、VP-16和5-FU的耐藥指數(shù)分別為9.41,8.54,11.74,6.77,13.41和8.88。PTL以濃度依賴的方式抑制SGC7901/DDP、SGC7901/ADR細(xì)胞增殖(P0.05),半數(shù)抑制率分別為22.61±2.55μmol/L、23.35±3.02μmol/L。10μmol/L PTL可逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞耐藥性。PTL10μmol/L可增加DDP、ADR對SGC7901/DDP、SGC7901/ADR細(xì)胞的增殖抑制率(P0.01),顯著降低DDP、ADR的半數(shù)抑制濃度,DDP IC50由35.1士3.24mg/L降至2.1士0.27mg/L,ADR IC50由29.21士2.67mg/L降至1.41士0.22mg/L。PTL可誘導(dǎo)胃癌耐藥細(xì)胞凋亡,亦可顯著增加DDP、ADR對胃癌耐藥細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡作用。與對照組凋亡率(6.88%±1.14%)比較,10μmol/L PTL誘導(dǎo)SGC7901/DDP細(xì)胞凋亡率為19.33%±2.51%(P0.05),2mg/LDDP誘導(dǎo)SGC7901/DDP細(xì)胞凋亡率為9.76%±1.78%(P0.05),聯(lián)合應(yīng)用時(shí)凋亡率顯著增加34.64%±3.9%(P0.01)。與對照組凋亡率(6.04%±1.33%)比較,10μmol/L PTL誘導(dǎo)SGC7901/ADR細(xì)胞凋亡率為20.24%±2.65%(P0.05),2mg/LADR誘導(dǎo)SGC7901/ADR細(xì)胞凋亡率為8.53%±1.66%(P0.05),聯(lián)合應(yīng)用時(shí)凋亡率顯著增加38.65%±4.79%(P0.01)。胃癌耐藥細(xì)胞的耐藥性與NF-κB的活化,耐藥相關(guān)基因的表達(dá)增加有關(guān);PTL可通過抑制NF-κB的活化,從而抑制耐藥相關(guān)基因P-gp、MRP、Bcl-2、CyclinD1的表達(dá)來逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥。對照組(SGC7901)、SGC7901/ADR經(jīng)PTL5、10、15μmol/L,SGC7901/DDP經(jīng)PTL5、15μmol/L,干預(yù)48h,檢測NF-κB的活性,P-gp、MRP、Bcl-2、CyclinD1的表達(dá),研究顯示,與對照組比較,SGC7901/DDP和SGC7901/ADR的NF-κB的活性明顯很高(P0.01),P-gp、MRP、Bcl-2、CyclinD1的表達(dá)亦顯著增加(P0.01);小白菊內(nèi)酯可明顯抑制SGC7901/DDP和SGC7901/ADR細(xì)胞中組NF-κB的活性,及細(xì)胞中P-gp、MRP、Bcl-2、CyclinD1的表達(dá)(P0.01),其抑制作用隨著PTL濃度增加而增強(qiáng)(P0.01)。結(jié)論:1、小白菊內(nèi)酯以濃度依賴的方式抑制SGC7901細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡,且可通過抑制DDP誘導(dǎo)的NF-κB活化,下調(diào)Bcl-2,激活Caspase-8,從而增加DDP對胃癌細(xì)胞的化療敏感性。2、SGC7901/DDP細(xì)胞具有穩(wěn)定的多藥耐藥性,并不受凍存及7代之內(nèi)的脫藥傳代影響。3、小白菊內(nèi)酯可濃度依賴性通過抑制胃癌耐藥細(xì)胞SGC7901/DDP、SGC7901/ADR中NF-κB的活化,從而調(diào)節(jié)Bcl-2、CyclinD1、P-gp、MRP的表達(dá),抑制胃癌耐藥細(xì)胞SGC7901/DDP、SGC7901/ADR的增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥細(xì)胞的耐藥性。
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.2
【部分圖文】：

PTL、DDP 單獨(dú)及聯(lián)合作用對 SGC7901 細(xì)胞增殖的影響(mean±SD,n=3)PTL 濃度μmol/L細(xì)胞抑制率(X±S )%DDP 濃度 mg/L細(xì)胞抑制率(X±S )%PTL10μmol/L+ DDP(mg/L)細(xì)胞抑制率(X±S )%0（對照） 0.00±0.00 0 0.00±0. 00 0 0.00±0. 005 14.12±1.35* 0.5 9.12±2.71 0.5 32.22±2.33*#10 28.22±2.51* 1.0 20.64±2.65* 1.0 56.12±4.21*#15 43.83±3.33* 2.0 33.93±3.41* 2.0 78.11±2.69*#20 57.82±0.96* 3.0 52.82±3.35* 3.0 88.65±3.45*#30 64.11±1.65* 4.0 58.11±2.67* 4.0 90.22±1.01*#50 83.33±0.88* 5.0 73.33±1.34* 5.0 91.35±1.22*#100 91.66±0.63* 10.0 89.66±0.88* 10.0 95.11±0.77*#*P<0.01vs 對照組，# P<0.01 PTL10μmol/L+ DDP 組 vs DDP 組

與對照組的凋亡率（10.65%±2.12%）比較，順鉑及小白菊內(nèi)酯誘導(dǎo)SGC7901 細(xì)胞凋亡率明顯增加分別為：20.16%±2.22%、26.14%±3.03%，與有顯著性差異（P<0.05）。DDP 聯(lián)合 PTL 組凋亡率為 67.14%±5.52%，與對照組及順鉑及小白菊內(nèi)酯單獨(dú)用藥組凋亡率比較，有顯著性差異（P<0.01），(見表 2，圖 2)。結(jié)果提示，PTL 及 DDP 可單獨(dú)誘導(dǎo) SGC7901 細(xì)胞凋亡，PTL 亦可顯著增加 DDP 對SGC7901 細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。表 2，PTL、DDP 單獨(dú)及聯(lián)合作用對 SGC7901 細(xì)胞凋亡的影響(mean 士 SD,n=3)分組 對照 PTL DDP PTL+DDP凋亡率10.65%±2.12% 20.16%±2.22%* 26.14%±3.03%* 67.14%±5.52%*#*P<0.01vs 對照組 # P<0.01vs DDP 組

BTL、DDP 單獨(dú)及聯(lián)合作用對 SGC7901 細(xì)胞 NF-κB 活的 EMSA 圖片，B：EMSA 灰度值柱狀圖，*P<0.01v 單獨(dú)及聯(lián)合作用對 Bcl-2 表達(dá)的影響認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的最后調(diào)控通路之一，大多數(shù)利用 Western-blot 方法檢測 SGC7901 細(xì)胞對照組0μmol/L）組以及 PTL（10μmol/L）聯(lián)合 DDP(2 4，對照組及 DDP 組 Bcl-2 呈高表達(dá)，與對照組達(dá)（P<0.01），DDP 組的 Bcl-2 表達(dá)無顯著差異明顯低于對照組及 DDP 組（P<0.01）。研究結(jié)

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