研究背景和目的：結直腸癌(colorectal cancer)是我國最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,在西方國家發(fā)病率和死亡率居腫瘤的第三位。近幾年,我國的結直腸癌的發(fā)病率呈明顯上升趨勢。結直腸癌發(fā)生發(fā)展是多因素、多步驟、多基因參與的復雜過程,發(fā)病早期,經過手術治療90%的病人可被治愈,然而臨床上約40%-50%的結直腸癌患者在確診時已出現了微轉移。結直腸癌的局部轉移一般早于遠處轉移,約60%-80%的患者在術后2年內出現局部轉移,轉移是導致患者死亡的重要原因。結直腸癌嚴重影響患者的生活質量和壽命,同時也給患者和社會帶來沉重的經濟負擔。目前,盡管對其已有了大量的研究與報道,但是迄今為止,結直腸癌的形成及轉移的分子基礎和機制尚不完全清楚。結直腸癌的發(fā)生是在多種致瘤因素的作用下,腸粘膜上皮細胞在基因水平失去了對其生長的正常調控,導致細胞周期紊亂,腸粘膜上皮細胞出現無限增殖,最終導致癌癥的發(fā)生。結直腸癌的轉移是一個多步驟、多階段、多基因參與的復雜過程,包括癌細胞從腫瘤的原發(fā)部位逃脫,進入周圍的基質,進而進入循環(huán)系統(tǒng)或淋巴系統(tǒng),粘附在內皮細胞壁的腫瘤細胞向血管外遷移,在遠處浸潤、血管增生最終形成新的轉移灶。該過程伴有多個基因的突變,其中包括眾多癌基因的激活。目前已報道有數百種基因參與結直腸癌轉移過程,而且數目仍在繼續(xù)增加。鑒于此,深入研究結直腸癌的發(fā)生發(fā)展的分子機制,在眾多的因素中尋找有效、敏感的、特異的結直腸癌轉移分子標志物,從而對結直腸癌轉移進行預警、診斷、干預以及預后判斷具有重要的臨床價值和社會效益。LIM激酶1(LIM Kinase 1,LIMK-1)基因是我們前期通過表達譜芯片篩選出來的一個在發(fā)生淋巴結轉移的結直腸癌組織中表達上調的基因。LIMK-1基因位于人類染色體7q11.23,含有39499個堿基,具有16個外顯子,該基因產生信使mRNA,可編碼全長LIMK-1蛋白。LIMK-1公認的作用是磷酸化ADF/cofilin的第3位絲氨酸(Ser3)而使其失活,繼而抑制F-actin形成G-acting,抑制Cofilin的引起的肌動蛋白解聚作用,參與肌動蛋白細胞骨架的重組,激動蛋白的聚合可形成偽足結構,從而調節(jié)細胞的運動和遷移,驅動腫瘤細胞遷移。近年來研究發(fā)現,LIMK-1蛋白不但在細胞骨架重組調控方面起著重要作用,還能夠介導膜結構中的肌動蛋白動態(tài)組裝和拆卸,如板狀偽足和絲狀偽足的形成,被認為是細胞運動的基礎,引起細胞的遷移和入侵。研究報道LIMK-1在乳腺癌和前列腺癌等多種惡性腫瘤中高表達,并和腫瘤發(fā)生、侵襲和轉移密切相關。然而,LIMK-1在結直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機制亦知之甚少。本課題擬檢測LIMK-1在結直腸癌中的表達情況,分析其表達與相關臨床病理參數之間的關系;通過體內外實驗,研究LIMK-1在結直腸癌發(fā)生、發(fā)展和轉移過程中的作用和相關的分子機制。方法：1.組織基因芯片分析LIMK-1為淋巴結轉移與非淋巴結轉移的結直腸癌中的差異表達基因；2.免疫組織化學(IHC)、免疫印跡(western blot)和免疫熒光(immunofluorescence)檢測結直腸癌石蠟樣本和新鮮組織樣本中LIMK-1的表達,并分析LIMK-1的表達定位與腫瘤分期、轉移和臨床預后等相關臨床病理參數的關系；3.引入核定位、核輸出信號,構建LIMK-1胞漿、胞核亞細胞定位表達載體,合成siRNA干擾LIMK-1的表達,通過瞬時轉染結直腸癌細胞株,在體外利用CCK8、transwell、劃痕實驗等分別檢測瞬時過表達及干擾LIMK-1對結直腸癌細胞增殖及遷移能力的影響；4.建立LIMK-1胞漿、胞核亞細胞定位穩(wěn)定過表達的結直腸癌細胞株,在體外通過CCK8、transwell實驗檢測細胞的增殖及遷移能力；在體內通過裸鼠皮下成瘤實驗檢測細胞的生長能力,裸鼠尾靜脈注射實驗檢測細胞的肺定植能力；5.利用western blot檢測LIMK-1瞬時過表達后信號通路的激活情況、EMT標志物表達的變化；6.利用帶HA抗體的Agroase篩選LIMK1相互作用的蛋白,質譜鑒定差異條帶,利用免疫共沉淀技術(Co-immunoprecipitation)及免疫熒光驗證候選蛋白與LIMK-1的相互作用。結果：1.LIMK-1E結直腸癌組織及細胞中表達水平的檢測1)基因芯片分析淋巴結轉移及無淋巴結轉移的結直腸癌LIMK-1的表達我們分別對八例淋巴結轉移及無淋巴結轉移的結直腸癌樣本進行基因芯片檢測,分析芯片結果從中選取了結直腸癌淋巴結轉移組及無淋巴結轉移組中表達具有2倍差異(p0.05)的LIMK-1作為后續(xù)候選基因。查閱文獻,LIMK-1在結直腸癌中未見報道。2) 結直腸癌組織中LIMK-1的表達IHC實驗表明LIMK-1陽性表達主要定位于細胞質和細胞核中,正常結直腸組織中LIMK-1蛋白表達水平低于相配對的腫瘤組織,LIMK-1蛋白在結直腸癌組織細胞漿過表達率17.7%(27/152)高于正常結直腸組織細胞漿過表達率0%(0/78)(p=0.000)；結直腸癌組織細胞核過表達率57.9%(88/152)高于正常結直腸組織細胞核過表達率17.9%(14/78) (p=0.000);western blot實驗結果也顯示正常結直腸組織中的LIMK-1蛋白表達水平低于相配對的腫瘤組織(p=0.0151)；組織免疫熒光結果顯示LIMK-1蛋白在正常組織中的表達水平較低,主要表達于組織的細胞漿;在癌組織中表達水平較高,主要表達于細胞漿與細胞核中。3)結直腸癌細胞系中LIMK-1在的表達western blot結果顯示人結直腸癌細胞株中LIMK-1蛋白在淋巴結轉移灶來源的LOVO、SW620及肝轉移亞系M5中高表達,在轉移潛能相對低的HCT116、 LS174T、SW480和HT29細胞系中表達相對較低；免疫熒光結果顯示,在轉移潛能相對低的HCT116、LS174T、SW480和HT29細胞系中表達相對較低,主要定位于細胞漿,在淋巴結轉移灶來源的LOVO、SW620細胞系中表達相對較高,陽性定位于細胞漿及細胞核。4) LIMK-1的表達和臨床病理參數之間的關系LIMK-1的表達水平與年齡組、性別腫瘤大小和腫瘤分化沒有顯著差異(P0.05);LIMK-1的表達與結直腸癌TNM分期相關,其中隨著結直腸癌細胞浸潤深度(T)增加LIMK-1的表達無顯著差異(P0.05),但隨著淋巴結轉移(N)發(fā)生,淋巴結轉移組(N1+N2)胞漿內LIMK-1過表達率高于無淋巴結轉移組(NO)胞漿內過表達率(P=0.007),淋巴結轉移組(N1+N2)胞核內LIMK-1過表達率高于無淋巴結轉移組(NO組)胞核內過表達率(P=0.000),并且隨著遠處轉移(M)發(fā)生,遠處轉移組(M1)胞漿內LIMK-1過表達率高于無遠處轉移組(M0)胞漿內過表達率(P=0.029),遠處轉移組(M1組)胞核內LIMK-1過表達率高于無遠處轉移組(M0)胞核內過表達率(P0.05)；復發(fā)組LIMK-1胞漿過表達率高于未復發(fā)組胞漿內過表達率(P=0.049),復發(fā)組LIMK-1胞核過表達率高于未復發(fā)組胞核內過表達率(P=0.000)。5) LIMK-1的表達水平與患者臨床預后的相關分析Kaplan-Meier法生存分析結果顯示,LIMK-1胞漿、胞核內過表達的結直腸癌患者總體生存率顯著低于低表達組,統(tǒng)計學上有顯著差異(Log-Rank,P0.05); LIMK-1胞漿、胞核內過表達的T3+T4和NO分期結直腸癌患者的總體生存率顯著低于低表達組,統(tǒng)計學上有顯著差異(Log-Rank,P0.05)。6)影響CRC患者預后的單因素與多因素分析單因素分析提示LIMK-1胞漿、胞核過表達與結直腸癌預后的相關,然而,目前逐步回歸分析的研究結果表明,LIMK-1的胞漿、胞核過表達并不能作為預測患者不良預后的獨立指標(p0.05)。2.LIMK-1的不同亞細胞定位對結直腸癌生物學特性的影響1)LIMK-1瞬時過表達對結直腸癌細胞增殖和侵襲的影響① LIMK-1瞬時過表達效果驗證我們引入核定位、核輸出信號,合成構建了LIMK-1胞漿、胞核亞細胞定位表達載體(HA-NLS-LIMK1、HA-NES-LIMK-1、HA-LIMK1)及空白對照組載體(HA),瞬時轉染內源性低表達LIMK-1的SW480、HCT116細胞,western blot檢測HA-LIMK1融合蛋白表達。結果表明轉染HA-LIMK-1、 HA-NES-LIMK-1、HA-NLS-LIMK-1細胞能表達HA-LIMK1融合蛋白。②LIMK-1瞬時過表達對結直腸癌細胞增殖能力的影響CCK8實驗結果顯示,在SW480和HCT116細胞中,瞬時過表達LIMK-1的細胞(HA-LIMK1、HA-NLS-LIMK1、HA-NES-LIMKl)與對照組(HA)相比的生長速度顯著上升,組別和時間存在交互效應,差異具有統(tǒng)計學意義(SW480, F=33.025, p0.001; HCT116, F=55.276, p0.001)。結果表明,LIMK-1的瞬時過表達在體外能夠促進結直腸癌細胞的增殖。③ LIMK-1瞬時過表達對結直腸癌細胞遷移能力的影響Transwell細胞遷移實驗結果顯示,在SW480和HCT116細胞中,瞬時過表達LIMK-1的細胞株(HA-LIMK1、HA-NLS-LIMK1、HA-NES-LIMKl)與對照組(HA)相比遷移細胞的數量明顯增多(P=0.000)；劃痕實驗結果顯示,瞬時過表達LIMK-1的細胞株(HA-LIMK1、HA-NLS-LIMK1、HA-NES-LIMK1)與對照組(HA)相比遷移率明顯增加(P=0.000)。上述實驗結果表明,LIMK-1的過表達在體外能夠增強結直腸癌細胞的侵襲遷移能力。2) LIMK-1瞬時沉默對結直腸癌細胞增殖和侵襲的影響①LIMK-1瞬時沉默效率驗證將陰性對照末端用帶綠色熒光的熒光標記物進行轉染效率評價結果顯示：siRNA oligo的轉染效率可達90%,具有較高的轉染效率,便于達到較好的基因沉默效果；將siRNA-377,siRNA-391,siRNA-1782片段分別轉染內源性高表達LIMK-1的SW620細胞,western blot結果顯示：轉染siRNA-377,siRNA-391兩個干擾片段的細胞LIMK-1蛋白的表達水平明顯下降,表明該兩個干擾片段可以成功敲低LIMK-1的表達。② LIMK-1瞬時沉默對結直腸癌細胞增殖能力的影響CCK8實驗結果顯示：在SW620細胞中,LIMK-1干擾組(siRNA-377、 siRNA-391)的生長速度顯著慢于對照組(NC),組別與時間存在交互效應,差異具有統(tǒng)計學意義(F=22.827,p0.001)。結果表明,LIMK-1的沉默在體外能夠抑制結直腸癌細胞的增殖。③ LIMK-1瞬時沉默對結直腸癌細胞遷移能力的影響Transwell細胞遷移實驗結果顯示：在SW620細胞中,LIMK-1瞬時干擾組(siRNA-377、siRNA-391)遷移細胞的數量顯著少于對照組(NC)(P=0.001)。結果表明,LIMK-1的沉默在體外能夠抑制結直腸癌細胞的遷移。3) LIMK-1穩(wěn)定過表達對結直腸癌細胞增殖和侵襲的影響①穩(wěn)定過表達LIMK-1細胞株SW480的構建與鑒定將HA空載體和HA-LIMK1、HA-NLS-LIMK1、HA-NES-LIMK1重組表達載體分別轉染SW480細胞,G418加壓篩選挑取抗性單克隆擴大培養(yǎng),western blot檢測結果表明已成功構建LIMK-1穩(wěn)定過表達細胞,分別命名為SW480/HA、 SW480/HA-LIMK1、SW480/HA-NLS-LIMK1、SW480/HA-NES-LIMK1;免疫熒光檢測結果顯示SW480/HA-LIMK1的外源性LIMK-1定位于細胞漿與細胞核內,SW480/HA-NLS-LIMK1的外源性LIMK1定位于細胞核內,SW480/HA-NES-LIMK1的外源性LIMK-1定位于細胞漿內,免疫熒光實驗結果表明LIMK-1穩(wěn)定過表達的細胞株構建成功,NLS核定位信號能夠將LIMK-1定位于細胞核,NES核輸出信號能夠將LIMK-1定位于細胞漿中。② LIMK-1穩(wěn)定過表達體外實驗CCK8實驗結果顯示,與對照組(SW480/HA)相比穩(wěn)定過表達LIMK-1的細胞株(SW480/HA-LIMK1、SW480/HA-NLS-LIMK1、 SW480/HA-NES-LIMK1)生長速度顯著上升,組別和時間存在交互效應,差異具有統(tǒng)計學意義(F=47.904,P0.001),實驗結果表明LIMK-1在胞漿、胞核亞細胞定位穩(wěn)定過表達在體外均能夠促進結直腸癌細胞的增殖；Transwell細胞遷移實驗結果顯示,穩(wěn)定過表達LIMK-1的細胞株(SW480/HA-LIMK1、 SW480/HA-NLS-LIMK1、SW480/HA-NES-LIMK1)與對照組(SW480/HA)相比遷移細胞的數量明顯增多(P=0.000),實驗結果表明LIMK-1在胞漿、胞核亞細胞定位穩(wěn)定過表達在體外均能夠促進結直腸癌細胞的遷移。③ LIMK-1穩(wěn)定過表達體內實驗裸鼠皮下成瘤實驗結果顯示,與對照組(SW480/HA)相比穩(wěn)定過表達LIMK-1的細胞株(SW480/HA-LIMK1、SW480/HA-NLS-LIMK1、 SW480/HA-NES-LIMK1)腫瘤生長速度較快,腫瘤重量較重(P=0.005),體積較大(P=0.017),同時, Ki67的陽性率(80.97%、74.08%、80.61%)顯著高于對照組SW480/HA (39.54%) (p=0.000),皮下成瘤實驗表明胞漿、胞核亞細胞定位穩(wěn)定過表達LIMK-1均能促進結直腸癌細胞體內生長和增殖；裸鼠尾靜脈注射實驗結果表明,穩(wěn)定過表達LIMK-1的細胞株(SW480/HA-LIMK1, SW480/HA-NLS-LIMK1、SW480/HA-NES-LIMK1)與對照組(SW480/HA)相比腫瘤細胞肺定植能力明顯增強,肺臟腫瘤結節(jié)數目明顯增多(p=0.009),尾靜脈注射實驗表明胞漿、胞核亞細胞定位穩(wěn)定過表達LIMK-1均能促進結直腸癌細胞體內肺定植能力。3.LIMK-1調控結直腸癌增殖轉移的分子機制1) LIMK-1過表達后AKT信號通路蛋白p-PTEN、p-AKT(473)、p-AKT(308)和AKT表達的影響western blotting檢測SW480、HCT116兩種結直腸癌細胞,瞬時轉染HA、HA-LIMK1、HA-NLS-LIMK1、HA-NES-LIMK1四個質粒后,p-PTEN、p-AKT (473)、p-AKT(308)、AKT的表達。結果顯示：SW480和HCT116細胞HA-LIMK1、HA-NLS-LIMK1、HA-NES-LIMK1三個處理組p-PTEN的表達較HA對照組表達低,HA-LIMK1、HA-NLS-LIMK1、HA-NES-LIMK1三個處理組p-AKT (473)、p-AKT(308)的表達較HA對照組高,AKT總蛋白量在4種處理細胞間無顯著差異,結果表明細胞漿與細胞核內的LIMK-1均可以調控AKT信號通路的活性。2) LIMK-1后對CRC細胞EMT相關分子標志物表達的影響western blot檢測SW480、HCT116兩種結直腸癌細胞,瞬時轉染HA、HA-LIMK1、HA-NLS-LIMK1、HA-NES-LIMK1四個質粒后,EMT相關分子標志物的變化。結果顯示：SW480和HCT116細胞HA-LIMK1、HA-NLS-LIMK1、 HA-NES-LIMK1三個處理組上皮標志物(E-cadherin、β-catenin)的表達較HA對照組表達量低;HA-LIMK1、HA-NLS-LIMK1、HA-NES-LIMK1三個處理組間葉標志物(N-cadherin、Fibronectin)的表達較HA對照組表達量高。以上結果表明,細胞漿與細胞核中的LIMK-1均可誘導結直腸癌細胞發(fā)生EMT轉化。3) LIMK-1相互作用蛋白的篩選采用帶HA標簽抗體的Agarose親和帶HA標簽的LIMK-1融合蛋白,結合的總蛋白經SDS-PAGE電泳分離。實驗組為SW480/HA-NES-LIMK1、 SW480/HA-NLS-LIMK1、SW480/HA-LIMK1,對照組為SW480/HA。經SDS-PAGE電泳分離,質譜兼容銀染后可見清晰蛋白條帶,分析得到多條差異蛋白條帶,初步篩選鑒定為MYH9(myosin-9,肌球蛋白重鏈9)、ACTN4(alpha-actinin4,細胞輔助動力蛋白)、DBN1(Drebrin)。4) LIMK-1與MYH9, ACTN4的直接結合檢測利用Co-IP檢測LIMK-1與MYH9、ACTN4的直接結合作用,結果顯示：LIMK-1與MYH9、ACTN4存在直接結合。5) LIMK-1與MYH9、ACTN4的共定位檢測利用免疫熒光顯微鏡檢測SW480/HA-LIMK-1細胞中LIMK-1和ACTN4、 MYH9的共定位情況,結果顯示LIMK-1與ACTN4、MYH9存在共定位。結論：結直腸癌組織中LIMK-1胞漿與胞核內的表達水平均顯著上調,胞漿、胞核內的LIMK-1具有增強結直腸癌細胞的增殖、侵襲和轉移能力。LIMK-1在胞漿、胞核內的過表達水平與患者淋巴結轉移(N)、遠處轉移(M)和預后等臨床病理參數之間呈正相關關系。
【學位單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：R735.34
【部分圖文】：

檢測了邋１５２例結直腸癌石蠟標本組織和７８例配對的癌旁組織中ＬＩＭＫ－１的表達，逡逑ＬＩＭＫ－１陽性表達主要定位于細胞質和細胞核中，呈棟紅色或黃褐色。結果顯逡逑示正常結直腸姐織ＬＩＭＫ－１蛋白表達水平低于相配對的腫瘤組織（圖１－２）；我逡逑們的阻Ｃ分析顯示，ＬＩＭＫ－１蛋白結直腸癌組織細胞漿陽性率６７．１％邋（１０２／１５２）逡逑高于正常結直腦組織細胞漿陽性率１０．３％邋（８／７８），差異具有統(tǒng)計學意義逡逑（ｐ＝０．０００），并且中度陽性和強陽性作為過表達或高表達，結直腸癌癌組織逡逑細胞漿過表達率１７．７％（２７／１５２）高于正常結直腸組織細胞漿過表達率０％（０／７８），逡逑差異具有統(tǒng)計學（Ｐ＝0．000）；結直腸癌癌組織細胞核陽性率９２．８％邋（１４１＾５２）逡逑與正常結直腸組織細胞核陽性率８５．９％邋（６７／７８）無顯著差異（ｐ＝０．０９４），但在逡逑結直腸癌癌組織中細胞核過表達率５７．９％邋（８８／１５２）高于正常結直腸組織細胞逡逑核過表達率１７．９％邋（１４／７８），差異具有統(tǒng)計學意義（ｐ＝０．０００）。（表１－１）。逡逑Ｎｏｒｍａｌ邐Ｔｕｍｏｕｒ邐Ｎｏｒｍａｌ邐Ｔｕｍｏｕｒ逡逑［網妽＾廠‘．‘Ｖ邋媒知p哄澹荊煎義仙杳浚謾で蒬趮

本文編號：2820813