目的:探討病毒巨噬細(xì)胞炎性蛋白ⅡN端肽(NT21MP)通過(guò)miR-155-3p逆轉(zhuǎn)人乳腺癌細(xì)胞紫杉醇耐藥的分子機(jī)制。方法:1.使用梯度濃度法構(gòu)建人乳腺癌細(xì)胞MCF-7紫杉醇耐藥株MCF-7/PR;2.qRT-PCR檢測(cè)NT21MP對(duì)miR-155-3p的調(diào)控以及miR-155-3p在人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和紫杉醇耐藥細(xì)胞株MCF-7/PR中不同的表達(dá)水平;3.生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)并使用雙熒光素酶報(bào)告載體驗(yàn)證miR-155-3p的靶基因MYD88;4.構(gòu)建并篩選穩(wěn)定的靶基因干擾片段以及過(guò)表達(dá)載體;5.qRT-PCR和Western Blot檢測(cè)miR-155-3p、靶基因MYD88對(duì)凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、Bak-1、Caspase-3表達(dá)影響;6.劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell趨化實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)miR-155-3p、靶基因MYD88對(duì)細(xì)胞的遷移、侵襲、周期和凋亡的影響;7.構(gòu)建人乳腺癌體內(nèi)模型,研究乳腺癌細(xì)胞MCF-7以及MCF-7/PR的成瘤性以及miR-155-3p對(duì)腫瘤成長(zhǎng)的影響;8.qRT-PCR和Western Blot檢測(cè)NT21MP聯(lián)合miR-155-3p mimics、MYD88干擾片段對(duì)乳腺癌耐藥株MCF-7/PR內(nèi)凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、Bak-1、Caspase-3的作用;9.劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell趨化實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NT21MP聯(lián)合miR-155-3p mimics、MYD88干擾片段對(duì)乳腺癌耐藥株MCF-7/PR遷移、侵襲、周期和凋亡的影響。結(jié)果:1.NT21MP可上調(diào)miR-155-3p的表達(dá)(P0.05);2.相比于MCF-7細(xì)胞,miR-155-3p在MCF-7/PR呈低水平表達(dá)(P0.05);3.生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)MYD88為miR-155-3p潛在的靶基因并通過(guò)qRT-PCR、Western Blot和雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證;4.miR-155-3p可抑制乳腺癌細(xì)胞的的生長(zhǎng),上調(diào)促凋亡基因Bax、Bak-1和Caspase-3而下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá),抑制細(xì)胞的遷移和侵襲能力(P0.05),而其靶基因MYD88則作用相反,促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖,增加細(xì)胞S期比例,增強(qiáng)細(xì)胞遷移和侵襲能力(P0.05);5.相比于單一因素處理,NT21MP聯(lián)合miR-155-3p mimics在調(diào)控MCF-7/PR凋亡和侵襲方面顯示出協(xié)同作用(P0.05),而在細(xì)胞遷移方面顯示為部分疊加(P0.05);7.相對(duì)于NT21MP或者si-MYD88單獨(dú)處理組,NT21MP聯(lián)合si-MYD88在促進(jìn)MCF-7/PR細(xì)胞凋亡和抑制侵襲能力中表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)(P0.05),抑制細(xì)胞遷移效果部分疊加(P0.05)。結(jié)論:NT21MP可通過(guò)上調(diào)miR-155-3p而下調(diào)MYD88的表達(dá),逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞紫杉醇耐藥,增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性,發(fā)揮抗乳腺癌作用。
【學(xué)位單位】：蚌埠醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R737.9
【部分圖文】：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果第一部分：miR-155-3p 調(diào)控人乳腺癌細(xì)胞紫杉醇耐藥機(jī)制研究1. miR-155-3p 靶基因的篩選及鑒定1.1 miR-155-3p 靶基因的篩選使 用 miRNA 靶 基 因 預(yù) 測(cè) 軟 件 TargetScan ， miRanda ， miRTarBase 預(yù) 測(cè)miR-155-3p 的靶基因，選定 MAPK14、DNAJB1、IRAK3、SIRT1、MYD88 共五個(gè)基因作為 miR-155-3p 潛在的靶基因（圖 1）

8 的 3'-UTR 區(qū)促進(jìn)其降解，導(dǎo)致 MYD88-3'-UTR WT-miR-155-3p 組熒光性顯著降低（P<0.05），而在 MYD88-3'-UTR MUT-miR-155-3p 組卻未化（P>0.05），表明靶基因 3'-UTR 與 miRNAs 結(jié)合位點(diǎn)的突變，導(dǎo)致 miR接靶向互補(bǔ)靶基因 mRNA3'-UTR 區(qū)域，阻斷了 miRNAs 直接對(duì)靶基因的 4）。

利用生物信息學(xué)軟件確定 miR-155-3p 與 MYD88 互補(bǔ)序列（圖3），構(gòu)建含 MYD88 3'-UTR 的熒光素酶報(bào)告載體，熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染 miR-155-3p mimics 使 miR-155-3p 在 MCF-7 細(xì)胞內(nèi)過(guò)度表達(dá)，結(jié)合于靶基因

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本文編號(hào)：2820316