發(fā)布時間：2020-09-11 10:59

　　 研究背景:彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(Diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)是成人非霍奇金淋巴瘤中最常見的一種類型。DLBCL屬于高度侵襲性淋巴瘤,發(fā)病后腫瘤能迅速轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)、脾臟、肝臟、骨髓及其他臟器。對于DLBCL的治療,CHOP已經(jīng)成為標(biāo)準(zhǔn)一線化療方案,再聯(lián)合CD20單抗的治療方案顯著提高了 DLBCL患者的生存率,但是由于DLBCL異質(zhì)性大,仍有近三分之一的DLBCL患者產(chǎn)生復(fù)發(fā)或耐藥。目前,旨在提高患者自體免疫功能以發(fā)揮更強(qiáng)抗腫瘤作用的免疫治療已成為研究熱點(diǎn)。相對傳統(tǒng)的化療、放療,免疫治療具有更輕副毒作用的優(yōu)勢。免疫治療中的DC(Dendric cell,DC)疫苗,即以腫瘤抗原激活DC誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答,其治療效果已得到了臨床驗(yàn)證,但因刺激DC的腫瘤抗原免疫原性較弱等原因還不能完全發(fā)揮其抗腫瘤作用優(yōu)勢。因此我們迫切希望尋找到一種與疾病相關(guān)的特異性抗原,能體現(xiàn)DLBCL不同亞型疾病的特征,進(jìn)而能引起更強(qiáng)的免疫應(yīng)答及靶向治療作用,提高DLBCL緩解率。外泌體(exosome,EXO)是多種細(xì)胞類型包括腫瘤細(xì)胞和造血細(xì)胞在內(nèi)的細(xì)胞都能分泌的一種納米級囊泡,尤其腫瘤細(xì)胞分泌量更大。外泌體攜帶其來源細(xì)胞及腫瘤微環(huán)境的獨(dú)有特征,參與了免疫抑制調(diào)節(jié)、腫瘤血管新生及轉(zhuǎn)移、抗腫瘤作用等多種生物過程。攜帶疾病獨(dú)有生物學(xué)特征的外泌體作為激活DC的腫瘤抗原有望更精準(zhǔn)地誘導(dǎo)抗腫瘤作用。然而,關(guān)于DLBCL EXOs的生物學(xué)特征及在腫瘤免疫中發(fā)揮的作用仍不明晰,有待進(jìn)一步研究。研究目的:研究DLBCL細(xì)胞分泌的外泌體特有的生物學(xué)特征,及在腫瘤免疫中發(fā)揮的多方面作用,為DLBCL的免疫治療探索一種新的治療模式。研究方法:(1)WB法、流式細(xì)胞儀、電鏡、NTA檢測、蛋白芯片、MicroRNA芯片檢測DLBCL EXOs的生物學(xué)特征,與Burkitt淋巴瘤細(xì)胞外泌體進(jìn)行比較區(qū)分獨(dú)有特征。(2)PKH67染色法檢測DLBCL EXOs被DC和腫瘤細(xì)胞攝取情況。(3)流式細(xì)胞儀檢測DLBCL EXOs作用后的受體細(xì)胞蛋白表達(dá)變化。(4)MTT法檢測DLBCL EXOs作用后基質(zhì)細(xì)胞增殖情況。(5)劃痕實(shí)驗(yàn)檢測DLBCL EXOs作用后HUVEC遷移情況。(6)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測DLBCL EXOs作用后的基質(zhì)細(xì)胞侵襲情況,WB和PCR分析侵襲相關(guān)蛋白變化。(7)體內(nèi)外基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)檢測DLBCL EXOs作用后血管新生情況(8)DLBCL EXOs荷瘤小鼠實(shí)驗(yàn)檢測DLBCL EXOs對腫瘤生長情況影響。(9)DLBCL EXOs負(fù)載DC后,CFSE染色法、流式細(xì)胞儀檢測DLBCL EXOs對T細(xì)胞功能影響情況。(10)腫瘤細(xì)胞來源外泌體(Tumorderived exosomes,TEXs)免疫后小鼠,在腫瘤負(fù)荷下,流式細(xì)胞儀、LDH細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)檢測外泌體的抗腫瘤作用。研究結(jié)果:(1)DLBCL 細(xì)胞分泌的 EXOs 表達(dá) c-myc、Bcl-2、Mcl-1、CD19、CD20 等特征性抗原,與同屬B細(xì)胞淋巴瘤的Raji細(xì)胞分泌的EXOs相比,具有明顯不同的特征。(2)DLBCL EXOs能被DC和淋巴瘤細(xì)胞輕易攝取,并呈時間依賴性。(3)DLBCL EXOs能轉(zhuǎn)運(yùn)分子到其他受體細(xì)胞。(4)DLBCL EXOs誘導(dǎo)Th2細(xì)胞凋亡,上調(diào)Th2細(xì)胞PD-1表達(dá),表明DLBCL EXO s可引起免疫抑制作用。(5)DLBCL EXOs能促進(jìn)基質(zhì)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、血管新生。(6)DLBCL EXOs小鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,DLBCL EXOs在體內(nèi)促進(jìn)腫瘤生長。(7)流式檢測DLBCL EXOs不能誘導(dǎo)DC凋亡。(8)DLBCL EXOs激活DC后,與T細(xì)胞共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)能刺激T細(xì)胞增殖,上調(diào)細(xì)胞因子IL-6和TNFα,下調(diào)抑制性細(xì)胞因子IL-4和IL-10。(9)TEXs免疫小鼠后,再遇腫瘤細(xì)胞攻擊后能發(fā)揮抗腫瘤作用。研究結(jié)論:(1)DLBCL EXOs攜帶特征性的腫瘤抗原,能被DC和腫瘤細(xì)胞攝取并能轉(zhuǎn)運(yùn)分子到其他受體細(xì)胞。(2)DLBCL EXOs能促進(jìn)基質(zhì)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、血管新生并對Th2細(xì)胞起到一定程度的免疫抑制作用。(3)DLBCL EXOs作為抗原激活DC后,與T細(xì)胞共培養(yǎng)能促進(jìn)T細(xì)胞功能。TEXs免疫小鼠后在腫瘤負(fù)荷下能起到抗腫瘤作用。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R733.1
【部分圖文】：

圖１．１．１邋ＰＥＧ沉淀法提取的Ａ２０邋ＥＸＯｓ逡逑（Ａ．負(fù)染觀察的外泌體（Ｘ８００００）；邋Ｂ？Ｄ．切片觀察的外泌體；Ｂ邋（Ｘ１１５００）、（Ｘ２０５００），邋Ｄ邋（Ｘ４４０００））逡逑．３．１．２邋ＰＥＧ沉淀法提取的外泌體的標(biāo)志性蛋白特征逡逑為了驗(yàn)證ＰＥＧ沉淀法提取的外泌體是否具有外泌體該有的標(biāo)志性特征，我用ＷＢ法來具體分析外泌體攜帶的蛋白成分。從ＷＢ結(jié)果來看，ＰＥＧ沉淀法的外泌體均能檢測到外泌體中標(biāo)志性蛋白四跨膜家族成員ＣＤ６３、ＣＤ８１的表休克蛋白ＨＳＰ－７０、ＧＡＰＤＨ都有少量表達(dá)，且沒有表達(dá)細(xì)胞株中富含的胞漿Ｃｙｔｏ－Ｃ。提示外泌體能表達(dá)來源細(xì)胞的一些特征如攜帶ＨＳＰ－７０、ＧＡＰＤＨ等。電鏡及ＷＢ研究結(jié)果都表明了邋ＰＥＧ沉淀法提取的外泌體都符合外泌體的經(jīng)征。詳見圖１．１．２。逡逑

１．１．２邋ＰＥＧ沉淀法提取的Ａ２０邋ＥＸＯｓ表達(dá)特征性蛋白逡逑淀法提取的外泌體中的蛋白分布特點(diǎn)逡逑泌體通過１０％濃度ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳分離后再經(jīng)考馬斯圖。如圖１．１．３．１可以明顯看出，細(xì)胞株本身含的蛋白外泌體大部分蛋白集中分布在５５？１３０ＫＤ。值得注意的豐富的區(qū)域。所以我們再次使用ＰＥＧ沉淀分離提取可能存在的外泌體進(jìn)行對比，果然同樣觀察到了類似的沉淀可能存在血清蛋白的污染。這與ＰＥＧ沉淀法的原理提高了外泌體的產(chǎn)量，但是也增加了其他蛋白污染的可養(yǎng)基１６４０和ＩＭＤＭ的泳道能觀察到類似的蛋白分布。淀的ＳＵ－ＤＨＬ－１６ＥＸＯＳ，與ＳＵ－ＤＨＬ１６細(xì)胞株全蛋白的發(fā)現(xiàn)竟然沒有檢測到跨膜四分子蛋白ＣＤ８１、ＣＤ６３表

１．１．３．２邋ＰＥＧ沉淀法提取的基礎(chǔ)培養(yǎng)基ＥＸＯｓ和ＳＵ－ＤＨＬ－１６邋ＥＸＯｓ的蛋白表．３．２邋ｅｘｏＥａｓｙ試劑盒提取外、泌體及鑒定逡逑３．２．１邋ｅｘｏＥａｓｙ試劑盒提取外說體形態(tài)學(xué)觀察逡逑為進(jìn)一步優(yōu)化外泌體的提取方法，我們又嘗試了一種同樣簡便易行的方ｅｘｏＥａｓｙ試劑盒提取外泌體。從電鏡結(jié)果看，ｅｘｏＥａｓｙ試劑盒提取的外泌體不觀察到典型的膜狀結(jié)構(gòu)，平均粒徑偏小。如圖１．２．１Ｃ－Ｄ背景較臟，雜質(zhì)較多，逡逑野不清晰，可見片狀的聚合物。詳見圖１．２．１。逡逑２０逡逑

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