發(fā)布時間：2020-09-10 21:30

　　 體液標(biāo)本中播散腫瘤細胞的檢測作為一種相對無創(chuàng)的液體活檢方式已廣泛用于腫瘤的早期診斷、治療指導(dǎo)、復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移評估,對腫瘤的個體化治療及預(yù)后評估等具有重要臨床意義。尤其是對于一些難以耐受活檢等侵入式檢查和難以獲得腫瘤組織標(biāo)本的患者,該檢查顯得尤為重要。目前,播散腫瘤細胞檢測面臨最大的挑戰(zhàn)是其在外周血和體液中的含量非常低,現(xiàn)有方法無法實現(xiàn)靈敏檢測。因此,本課題設(shè)計了基于適體識別靶細胞并觸發(fā)細胞表面原位滾環(huán)擴增的新方法用于體液中稀有腫瘤細胞的高靈敏檢測。本課題以乳腺癌細胞MCF-7為模式檢測對象,設(shè)計一條上皮細胞黏附分子(EpCAM)適體-引物復(fù)合探針,其中適體部分作為識別元件特異地識別結(jié)合EpCAM陽性腫瘤細胞,隨后引物部分可觸發(fā)細胞表面原位滾環(huán)擴增,產(chǎn)生大量富含鳥嘌呤的G四聯(lián)體序列。G-四聯(lián)體/hemin DNA酶折疊形成后可以催化比色反應(yīng)實現(xiàn)腫瘤細胞的檢測。在混有不同濃度靶細胞的懸液(細胞總數(shù)為105個)中,本方法得到的最低檢測限為10個腫瘤細胞,即低至0.01%的靶細胞仍可被檢出。針對10例臨床體液標(biāo)本檢測(包括5例良性體液標(biāo)本和5例不同來源的惡性體液標(biāo)本),該方法展示了良好的特異性和臨床適用性。本文建立的基于適體識別靶細胞觸發(fā)表面滾環(huán)擴增的腫瘤細胞檢測新方法具有簡單快速、靈敏度高、特異性好的優(yōu)點;并成功用于臨床體液標(biāo)本中稀有腫瘤細胞的檢測。該方法為外周血或體液中稀有腫瘤細胞的檢測提供了新的技術(shù)支持,具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R730.43
【部分圖文】：

為了進一步驗證ＲＣＡ產(chǎn)物與Ｈｅｍｉｎ結(jié)合后可以催化ＡＢＴＳ－Ｈ２０２系統(tǒng)，我們逡逑通過紫外分光度計測量４００邋ｒｎｎ到５００邋ｎｍ波長的吸光度變化，取４１８邋ｎｍ處的吸光逡逑度測量值為結(jié)果，可看到有一個明顯的特征峰（圖２Ｂ），說明基于適體觸發(fā)ＲＣＡ逡逑產(chǎn)物中的Ｇ－四聯(lián)體序列與Ｈｅｍｉｎ結(jié)合后形成了邋Ｇ－四聯(lián)體／ｈｅｍｉｎ邋ＤＮＡ酶，催化底逡逑物發(fā)生比色反應(yīng)使吸光度產(chǎn)生變化。與此同時，我們也測量了空白與沒有加入ＡＰＰ逡逑只有純化環(huán)狀模板參與的ＲＣＡ產(chǎn)物的吸光度值，結(jié)果顯示波長４１８邋ｎｍ處幾乎沒逡逑有明顯的特征峰，進一步的證明了環(huán)狀模板已經(jīng)成功被純化，在沒有引物存在的逡逑情況下自身不會發(fā)生ＲＣＡ反應(yīng)無背景信號產(chǎn)生，而且結(jié)果同時還證明了游離的逡逑Ｈｅｍｉｎ不會催化ＡＢＴＳ－Ｈ２０２系統(tǒng)產(chǎn)生背景信號。所以，在后續(xù)的細胞實驗中離心逡逑后不需要去除游離的Ｈｅｍｉｎ。逡逑Ｍｌ邋２邐３邐４邐５邐＾逡逑Ａ邐Ｂ逡逑，Ａ逡逑ｍ邋４２ａ邐４４？邐ｍ逡逑）．（ｎｍ）逡逑圖２邋（Ａ）聚丙烯酰胺凝膠電泳表征圖：（條帶１）引物探針

為了實現(xiàn)最優(yōu)的檢測性能，我們對幾個實驗條件進行了優(yōu)化。首先，多功能逡逑的ＡＰＰ含有觸發(fā)ＲＣＡ的引物部分，對結(jié)果有重要的影響意義。因此，ＡＰＰ與細逡逑胞懸液的反應(yīng)時間首先被優(yōu)化［１７］。如圖４Ａ所示，吸光度信號隨著ＡＰＰ反應(yīng)的時逡逑間增加而上升，在反應(yīng)４０分鐘時達到最大值，所以４０分鐘被選為最佳的反應(yīng)時逡逑間。另外，ＲＣＡ的時間也是一個重要參數(shù)［３６］。依據(jù)圖４Ｂ所示，吸光度信號隨著逡逑ＲＣＡ反應(yīng)時間增加而上升，在反應(yīng)４０分鐘后達到最大值。但繼續(xù)延長反應(yīng)時間并逡逑沒有使信號增加反而使信號降低，這可能是因為延長反應(yīng)時間使ＲＣＡ產(chǎn)物分子量逡逑太大而從細胞表面脫離。因此，我們選擇４０分鐘作為最佳反應(yīng)時間。為了提高檢逡逑測效率，我們同樣分析了邋Ｈｅｍｉｎ濃度的影響，發(fā)現(xiàn)在１．４邋ｍＭ時達到最大值。逡逑Ａ邐Ｂ邋｜邋０］邐Ｃ邋ｕ逡逑�。海海。海哄澹剩。殄义希保斑姡玻板澹礤澹矗斑�？邐１０邐２０邐３？邐４４１邐５０邐Ｕ邋＊？＊邐１（４逡逑Ｉｎｃｕｂｔｔｉｏｎ邋Ｔｉｍ？邋（ｎｔｉｎ）邐ＲＣＡ邋Ｔｉｍｅ邋（ｍ邋Ｉｎ）邐Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｈｅｒｎｉａ邋（ｐＭ）逡逑圖４實驗條件優(yōu)化：所有的吸光度均在１０５個ＭＣＦ－７細胞下測定。（Ａ）邋ＡＰＰ反應(yīng)時間，（Ｂ）逡逑ＲＣＡ反應(yīng)時間

為了模擬真實的惡性體液樣本，我們把不同數(shù)量的ＭＣＦ－７細胞混入正常的白逡逑細胞中保證細胞總數(shù)為１0５個［３７］。在上述最優(yōu)的實驗條件下，吸光度隨著ＭＣＦ－７逡逑靶細胞數(shù)量的增加而增加（圖５Ａ）。ＭＣＦ－７靶細胞數(shù)量的對數(shù)從１０到３００００個細逡逑胞之間與其吸光度信號與有著較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為０．９９７邋（圖５Ｂ）。最低逡逑檢測線可達１０個靶細胞／ｍＬ，相當(dāng)于在總數(shù)為１０５個細胞混合液中可檢測到０．０１％逡逑ＭＣＦ－７細胞，展示了本策略良好的檢測低豐度腫瘤細胞的分析性能。相比于之前逡逑報道的比色分析和基于適體標(biāo)記納米粒子［２３，２４］和適體修飾傳感器表面［３７，２２，３８］檢測逡逑腫瘤細胞的方法，本方案有著更優(yōu)或相當(dāng)?shù)撵`敏度（表２）。這是因為本方法結(jié)合逡逑了邋ＥｐＣＡＭ適體的高特異性和細胞表面ＲＣＡ反應(yīng)的氋效信號擴增能力以及Ｇ－四聯(lián)逡逑體／ｈｅｍｉｎＤＮＡ酶的高催化能力。與之前報道過檢測腫瘤細胞生物傳感方法最不同逡逑的一點是，本方法良好的分析性能是通過模擬真實臨床標(biāo)本將低豐度腫瘤細胞混逡逑入大量的正常白細胞中得到的，而不是簡單的檢測純的腫瘤細胞。逡逑（ｊ邋Ｂ逡逑ｉ．ａ－邐｜逡逑Ｉ邐＼邐Ｓ邋ｔ逡逑＾〔二 邐邐：邋0＿丨＿邋■逡逑￣＾￣ｍ￣Ｚ￣Ｚ￣邐＂邋？邐Ｚ１邋￣＾￣＾￣ｒａｉ７逡逑Ｎｕｍｂｅｒ邋ｏｆ邋＞１ＣＦ－７逡逑圖５邋（Ａ）紫外吸收光譜圖

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