體液標本中播散腫瘤細胞的檢測作為一種相對無創(chuàng)的液體活檢方式已廣泛用于腫瘤的早期診斷、治療指導、復發(fā)與轉移評估,對腫瘤的個體化治療及預后評估等具有重要臨床意義。尤其是對于一些難以耐受活檢等侵入式檢查和難以獲得腫瘤組織標本的患者,該檢查顯得尤為重要。目前,播散腫瘤細胞檢測面臨最大的挑戰(zhàn)是其在外周血和體液中的含量非常低,現(xiàn)有方法無法實現(xiàn)靈敏檢測。因此,本課題設計了基于適體識別靶細胞并觸發(fā)細胞表面原位滾環(huán)擴增的新方法用于體液中稀有腫瘤細胞的高靈敏檢測。本課題以乳腺癌細胞MCF-7為模式檢測對象,設計一條上皮細胞黏附分子(EpCAM)適體-引物復合探針,其中適體部分作為識別元件特異地識別結合EpCAM陽性腫瘤細胞,隨后引物部分可觸發(fā)細胞表面原位滾環(huán)擴增,產生大量富含鳥嘌呤的G四聯(lián)體序列。G-四聯(lián)體/hemin DNA酶折疊形成后可以催化比色反應實現(xiàn)腫瘤細胞的檢測。在混有不同濃度靶細胞的懸液(細胞總數(shù)為105個)中,本方法得到的最低檢測限為10個腫瘤細胞,即低至0.01%的靶細胞仍可被檢出。針對10例臨床體液標本檢測(包括5例良性體液標本和5例不同來源的惡性體液標本),該方法展示了良好的特異性和臨床適用性。本文建立的基于適體識別靶細胞觸發(fā)表面滾環(huán)擴增的腫瘤細胞檢測新方法具有簡單快速、靈敏度高、特異性好的優(yōu)點;并成功用于臨床體液標本中稀有腫瘤細胞的檢測。該方法為外周血或體液中稀有腫瘤細胞的檢測提供了新的技術支持,具有廣闊的臨床應用前景。
【學位單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R730.43
【部分圖文】：

為了進一步驗證ＲＣＡ產物與Ｈｅｍｉｎ結合后可以催化ＡＢＴＳ－Ｈ２０２系統(tǒng)，我們逡逑通過紫外分光度計測量４００邋ｒｎｎ到５００邋ｎｍ波長的吸光度變化，取４１８邋ｎｍ處的吸光逡逑度測量值為結果，可看到有一個明顯的特征峰（圖２Ｂ），說明基于適體觸發(fā)ＲＣＡ逡逑產物中的Ｇ－四聯(lián)體序列與Ｈｅｍｉｎ結合后形成了邋Ｇ－四聯(lián)體／ｈｅｍｉｎ邋ＤＮＡ酶，催化底逡逑物發(fā)生比色反應使吸光度產生變化。與此同時，我們也測量了空白與沒有加入ＡＰＰ逡逑只有純化環(huán)狀模板參與的ＲＣＡ產物的吸光度值，結果顯示波長４１８邋ｎｍ處幾乎沒逡逑有明顯的特征峰，進一步的證明了環(huán)狀模板已經成功被純化，在沒有引物存在的逡逑情況下自身不會發(fā)生ＲＣＡ反應無背景信號產生，而且結果同時還證明了游離的逡逑Ｈｅｍｉｎ不會催化ＡＢＴＳ－Ｈ２０２系統(tǒng)產生背景信號。所以，在后續(xù)的細胞實驗中離心逡逑后不需要去除游離的Ｈｅｍｉｎ。逡逑Ｍｌ邋２邐３邐４邐５邐＾逡逑Ａ邐Ｂ逡逑，Ａ逡逑ｍ邋４２ａ邐４４？邐ｍ逡逑）．（ｎｍ）逡逑圖２邋（Ａ）聚丙烯酰胺凝膠電泳表征圖：（條帶１）引物探針

為了實現(xiàn)最優(yōu)的檢測性能，我們對幾個實驗條件進行了優(yōu)化。首先，多功能逡逑的ＡＰＰ含有觸發(fā)ＲＣＡ的引物部分，對結果有重要的影響意義。因此，ＡＰＰ與細逡逑胞懸液的反應時間首先被優(yōu)化［１７］。如圖４Ａ所示，吸光度信號隨著ＡＰＰ反應的時逡逑間增加而上升，在反應４０分鐘時達到最大值，所以４０分鐘被選為最佳的反應時逡逑間。另外，ＲＣＡ的時間也是一個重要參數(shù)［３６］。依據(jù)圖４Ｂ所示，吸光度信號隨著逡逑ＲＣＡ反應時間增加而上升，在反應４０分鐘后達到最大值。但繼續(xù)延長反應時間并逡逑沒有使信號增加反而使信號降低，這可能是因為延長反應時間使ＲＣＡ產物分子量逡逑太大而從細胞表面脫離。因此，我們選擇４０分鐘作為最佳反應時間。為了提高檢逡逑測效率，我們同樣分析了邋Ｈｅｍｉｎ濃度的影響，發(fā)現(xiàn)在１．４邋ｍＭ時達到最大值。逡逑Ａ邐Ｂ邋｜邋０］邐Ｃ邋ｕ逡逑�。海海。海哄澹剩。殄义希保斑姡玻板澹礤澹矗斑姡窟姡保斑姡玻斑姡�？邐４４１邐５０邐Ｕ邋＊？＊邐１（４逡逑Ｉｎｃｕｂｔｔｉｏｎ邋Ｔｉｍ？邋（ｎｔｉｎ）邐ＲＣＡ邋Ｔｉｍｅ邋（ｍ邋Ｉｎ）邐Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｈｅｒｎｉａ邋（ｐＭ）逡逑圖４實驗條件優(yōu)化：所有的吸光度均在１０５個ＭＣＦ－７細胞下測定。（Ａ）邋ＡＰＰ反應時間，（Ｂ）逡逑ＲＣＡ反應時間

為了模擬真實的惡性體液樣本，我們把不同數(shù)量的ＭＣＦ－７細胞混入正常的白逡逑細胞中保證細胞總數(shù)為１0５個［３７］。在上述最優(yōu)的實驗條件下，吸光度隨著ＭＣＦ－７逡逑靶細胞數(shù)量的增加而增加（圖５Ａ）。ＭＣＦ－７靶細胞數(shù)量的對數(shù)從１０到３００００個細逡逑胞之間與其吸光度信號與有著較好的線性關系，相關系數(shù)為０．９９７邋（圖５Ｂ）。最低逡逑檢測線可達１０個靶細胞／ｍＬ，相當于在總數(shù)為１０５個細胞混合液中可檢測到０．０１％逡逑ＭＣＦ－７細胞，展示了本策略良好的檢測低豐度腫瘤細胞的分析性能。相比于之前逡逑報道的比色分析和基于適體標記納米粒子［２３，２４］和適體修飾傳感器表面［３７，２２，３８］檢測逡逑腫瘤細胞的方法，本方案有著更優(yōu)或相當?shù)撵`敏度（表２）。這是因為本方法結合逡逑了邋ＥｐＣＡＭ適體的高特異性和細胞表面ＲＣＡ反應的氋效信號擴增能力以及Ｇ－四聯(lián)逡逑體／ｈｅｍｉｎＤＮＡ酶的高催化能力。與之前報道過檢測腫瘤細胞生物傳感方法最不同逡逑的一點是，本方法良好的分析性能是通過模擬真實臨床標本將低豐度腫瘤細胞混逡逑入大量的正常白細胞中得到的，而不是簡單的檢測純的腫瘤細胞。逡逑（ｊ邋Ｂ逡逑ｉ．ａ－邐｜逡逑Ｉ邐＼邐Ｓ邋ｔ逡逑＾〔二 邐邐：邋0＿丨＿邋■逡逑￣＾￣ｍ￣Ｚ￣Ｚ￣邐＂邋？邐Ｚ１邋￣＾￣＾￣ｒａｉ７逡逑Ｎｕｍｂｅｒ邋ｏｆ邋＞１ＣＦ－７逡逑圖５邋（Ａ）紫外吸收光譜圖

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