前言:胃癌是世界上第二大因癌癥而造成的死亡原因,也是東北亞地區(qū)發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一。盡管采用多種方法來提高胃癌患者的生存率,但晚期胃癌患者的生存時間仍然很短,有效的治療方法有限。因此,確定新的早期診斷生物標志物和開展新的抗癌靶向治療勢在必行。研究發(fā)現(xiàn),非編碼RNA,尤其是microRNA(miRNA,miR),在腫瘤進展過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。miRNA是一類內(nèi)源性的、非編碼單鏈小RNA,大概19-25個核苷酸長度。miRNA可以識別特定的靶基因,并能夠特異性的與靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)(3’-UTR)結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后水平直接促進靶基因mRNA的降解和/或抑制靶蛋白的翻譯,在腫瘤細胞中起抑癌基因或促癌基因的作用,參與到細胞的分化、增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)過程中。研究結(jié)果表明,許多的miRNA,如miR-122,miR-26a、和miR-200c等,在胃癌中表達出現(xiàn)失調(diào),這表明miRNA可能作為胃癌診斷及預(yù)后判斷的一類新的標志物。mir-1236-3p,是一種內(nèi)含子miRNA,位于染色體6p21.33上,包含在NELFE基因的內(nèi)含子中。越來越多的證據(jù)表明,miR-1236-3p在腫瘤中可能起到了抑制基因的作用,在多種腫瘤中已出現(xiàn)miR-1236-3p表達下調(diào)。例如,在原發(fā)性肝細胞癌中,miR-1236-3p下調(diào)甲胎蛋白(AFP),從而導(dǎo)致PTEN的積累,信號通路PI3K/Akt受到抑制。在高分化漿液性卵巢癌中,miR-1236-3p通過作用于靶基因ZEB1來使細胞的遷移和侵襲能力受到抑制。此外,miR-1236-3p表達下調(diào)在膀胱癌、肺癌和乳腺癌中也有報道,然而,它在胃癌中的生物學(xué)功能到目前為止仍不清楚。通過初步檢測,我們發(fā)現(xiàn)miR-1236-3p在胃癌呈現(xiàn)顯著下調(diào),可能作為胃癌的診斷以及治療的一個潛在標志物和靶點。目的:本研究的目的是探討miR-1236-3p在人類胃癌組織及胃癌細胞系中的表達情況,以及與胃癌的發(fā)生發(fā)展及臨床病理學(xué)特征的關(guān)系,進行miR-1236-3p功能學(xué)實驗以探究其生物學(xué)作用,鑒定其調(diào)控的靶基因,并檢測miR-1236-3p上調(diào)或下調(diào)后對細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和PI3K/Akt信號通路的影響。為研究胃癌發(fā)展機制以及胃癌的基因治療和靶向治療提供新的途徑和靶點。方法:1.實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測miR-1236-3p在83例胃癌組織和配對癌旁組織中的表達,分析兩者表達水平上的差異以及與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系;同時,使用qRT-PCR檢測miR-1236-3p在人正常胃粘膜上皮細胞株GES-1和胃癌細胞株MKN-45、SGC-7901及MGC-803中的表達情況。2.運用慢病毒顆粒對SGC-7901細胞中的miR-1236-3p進行過表達,在MKN-45細胞中抑制miR-1236-3p的表達。體外實驗部分,CCK-8法檢測miR-1236-3p對胃癌細胞增殖能力產(chǎn)生的影響;劃痕愈合實驗和transwell遷移實驗用來檢測miR-1236-3p對胃癌細胞遷移能力的作用;transwell侵襲實驗驗證miR-1236-3p是否對胃癌細胞的侵襲能力造成影響。體內(nèi)實驗部分,通過裸鼠皮下移植瘤模型,分析驗證miR-1236-3p對裸鼠體內(nèi)移植瘤的生長能力的作用。3.使用在線靶基因預(yù)測軟件預(yù)測miR-1236-3p的與轉(zhuǎn)移相關(guān)的靶基因,并通過雙熒光素酶檢測技術(shù)對miR-1236-3p與其靶基因的結(jié)合位點進行進一步明確;qRT-PCR和Western blot檢測過表達miR-1236-3p或抑制miR-1236-3p的表達對靶基因的影響。4.觀察miR-1236-3p過表達組和抑制組細胞的形態(tài)變化情況。Western blot分別檢測miR-1236-3p過表達組、抑制組、各陰性對照組和空白對照組細胞內(nèi)E-鈣粘蛋白和N-鈣粘蛋白的表達變化。5.Western blot檢測miR-1236-3p過表達組、抑制組以及陰性對照組細胞內(nèi)p-AKT(Ser473)和AKT在蛋白水平的表達變化。結(jié)果:1.qRT-PCR結(jié)果顯示miR-1236-3p在83例胃癌組織中表達水平明顯低于配對的癌旁組織(P0.001)。在胃癌中miR-1236-3p的表達水平與病變的TNM分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切,胃癌中的miR-1236-3p表達越低,TNM分期就越晚(P=0.003),分化程度也越差(P=0.015);而miR-1236-3p表達越高,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率就會越低(P=0.018)。2.把人胃正常粘膜上皮細胞GES-1作為對照組,miR-1236-3p在胃癌細胞系SGC-7901、MKN-45和MGC-803中的表達水平顯著低于人胃正常粘膜上皮細胞株(P0.05)。其中,miR-1236-3p在SGC-7901細胞中的表達相對最低,在MKN-45細胞中表達相對最高,因此,過表達SGC-7901細胞中miR-1236-3p的水平,抑制MKN-45細胞中miR-1236-3p的表達水平。3.CCK-8測胃癌細胞OD值,結(jié)果顯示:過表達miR-1236-3p可明顯抑制胃癌細胞的增殖(P0.01),抑制miR-1236-3p的表達能顯著促進胃癌細胞的增殖(P0.01)。4.劃痕愈合實驗顯示miR-1236-3p能減慢傷口愈合,降低胃癌細胞的遷移能力,SGC-7901細胞miR-1236-3p過表達組48h后劃痕仍有較寬的距離,而兩組對照組劃痕有明顯的變窄。抑制miR-1236-3p表達的MKN-45細胞48h后劃痕明顯比對照組窄。Transwell遷移實驗的結(jié)果中,與對照組相比,SGC-7901細胞miR-1236-3p過表達組48h后Transwell小室每個視野中的細胞數(shù)明顯減少,P0.01;而MKN-45細胞miR-1236-3p抑制組48h后細胞數(shù)明顯增多,P0.05。兩實驗均提示miR-1236-3p對胃癌細胞遷移能力具有抑制作用。5.Transwell侵襲實驗證實,miR-1236-3p能夠顯著降低胃癌細胞的侵襲能力。與對照組相比,SGC-7901細胞miR-1236-3p過表達組48h后Transwell小室中每視野內(nèi)的細胞數(shù)明顯減少,P0.001;而MKN-45細胞miR-1236-3p抑制組48h后每視野內(nèi)的細胞數(shù)明顯增多,P0.01。6.裸鼠成瘤模型結(jié)果顯示,miR-1236-3p過表達組腫瘤體積明顯減小(P0.01),腫瘤重量明顯減輕(P0.01)。7.通過靶基因在線預(yù)測軟件Targetscan,miRDB和miRanda,我們推測MTA2可能是miR-1236-3p的靶基因。qRT-PCR和Western blot檢測miR-1236-3p過表達組和抑制組MTA2表達結(jié)果,證實MTA2在mRNA水平和蛋白水平的表達都有所變化,miR-1236-3p是通過轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因MTA2的表達。再結(jié)合雙熒光素酶實驗結(jié)果,進一步驗證了MTA2是miR-1236-3p腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)靶基因。8.通過Western blot實驗檢測miR-1236-3p過表達組、抑制組及各對照組細胞內(nèi)E-鈣粘蛋白和N-鈣粘蛋白表達結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)當miR-1236-3p過度表達時,E-鈣粘蛋白表達升高(P0.001),但是N-鈣粘蛋白表達降低(P0.001);miR-1236-3p抑制后,E-鈣粘蛋白表達降低(P0.05),但是N-鈣粘蛋白表達增加(P0.001)。同時,觀察miR-1236-3p過表達組和抑制組細胞的形態(tài)變化發(fā)現(xiàn),與正常對照組細胞相比,miR-1236-3p過表達組的SGC-7901細胞形態(tài),從一個擴展延伸的形態(tài)向更有組織的細胞與細胞間緊密接觸的形態(tài)轉(zhuǎn)變,而在miR-1236-3p抑制組MKN-45細胞中則有相反的結(jié)果。9.Western blot實驗檢測miR-1236-3p過表達組、抑制組及各對照組細胞內(nèi)pAKT(Ser473)和AKT在蛋白水平的表達變化結(jié)果顯示,miR-1236-3p過表達組的p-AKT蛋白表達水平明顯低于對照組,P0.001;而在miR-1236-3p抑制組的pAKT蛋白表達水平明顯高于對照組,P0.001。各組的AKT蛋白的表達水平無明顯不同。結(jié)論:1.miR-1236-3p在胃癌細胞株和胃癌組織中的表達均呈現(xiàn)明顯降低,miR-1236-3p的低表達與胃癌患者的TNM分期,分化程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移都存在密切聯(lián)系。2.miR-1236-3p在胃癌中表現(xiàn)為抑癌基因的作用,對胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移產(chǎn)生抑制作用。3.miR-1236-3p直接下調(diào)靶基因MTA2的表達來抑制胃癌侵襲轉(zhuǎn)移,通過對靶基因調(diào)控抑制胃癌發(fā)展。4.miR-1236-3p直接抑制了胃癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程,并且對PI3K/Akt信號通路也產(chǎn)生抑制作用。miR-1236-3p/MTA2調(diào)控機制為胃癌轉(zhuǎn)移的研究提供了一個新機制,并為胃癌治療提供了一個潛在新靶點。
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.2
【部分圖文】：
中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文差（P=0.015），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；miR-1236-3p 表達越高轉(zhuǎn)移的幾率越低，P=0.018，差異同樣具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義。而水平與患者的年齡、性別、腫瘤大小等其他臨床病理學(xué)特征無
miR-1236-3p在胃癌細胞系和正常胃粘膜上皮細胞中的相對表達數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，*表示P＜0.05
胃癌細胞SGC-7901轉(zhuǎn)染mimic后的轉(zhuǎn)染效率評價
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本文編號：
2816230
