研究背景:三氧化二砷是治療急性早幼粒細(xì)胞白血病的常用藥物,但是其對實(shí)體腫瘤的治療一直受限于高劑量所致的毒副作用以及腫瘤細(xì)胞的化療藥物抵抗作用。作者團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)二甲雙胍對三氧化二砷藥物增敏效果顯著高于吉西他濱、5-FU、索拉菲尼等幾種膽管癌常用藥物。肝內(nèi)膽管癌是肝臟的第二大惡性腫瘤,患者預(yù)后極差,化療敏感性低,如何找到低毒有效的治療藥物,是當(dāng)前臨床醫(yī)生所面臨的棘手難題。此外,三氧化二砷常引起一些較為嚴(yán)重的治療副反應(yīng),如肝毒性、皮膚病、神經(jīng)毒性、腎毒性和心臟毒性等,常常限制了三氧化二砷的臨床應(yīng)用。肝臟是三氧化二砷作用的主要器官,三氧化二砷可通過誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生,損傷肝細(xì)胞。此外,二甲雙胍通過抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ產(chǎn)生的少量內(nèi)源性的ROS可以延長線蟲的壽命,其機(jī)制可能與二甲雙胍間接誘導(dǎo)產(chǎn)生的過氧化物酶PRDX-2有關(guān)。研究目的:1.探索二甲雙胍聯(lián)合三氧化二砷對肝內(nèi)膽管癌的抑制作用。2.探索二甲雙胍聯(lián)合三氧化二砷對肝內(nèi)膽管癌的抑制作用的分子機(jī)制。3.探索二甲雙胍對三氧化二砷引起的肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。研究方法:1.通過細(xì)胞活性試驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞內(nèi)活性氧水平和裸鼠移植瘤抑制試驗(yàn)等,在細(xì)胞和動物水平,證明二甲雙胍聯(lián)合三氧化二砷對肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞的增殖抑制作用,并計(jì)算兩藥抑制腫瘤細(xì)胞的協(xié)同系數(shù)。2.我們用western blot技術(shù)檢測了二甲雙胍和三氧化二砷處理后肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌內(nèi)AMPK、p38MAPK、ERK3和mTOR通路的變化;細(xì)胞水平上,我們通過基因沉默、過表達(dá)及激酶抑制劑和激活劑的手段先后分別下調(diào)和上調(diào)AMPK、p38MAPK及ERK3蛋白的表達(dá)或活性,檢測二甲雙胍和三氧化二砷處理后膽管癌細(xì)胞的功能學(xué)及相關(guān)蛋白的表達(dá)變化;在73例肝內(nèi)膽管癌患者腫瘤組織中檢測了ERK3蛋白的表達(dá)水平,分析其與患者臨床病理指標(biāo)及預(yù)后的關(guān)系。3.用小鼠正常肝細(xì)胞AML12和昆明小鼠構(gòu)建三氧化二砷肝損傷的細(xì)胞和小鼠模型。檢測細(xì)胞凋亡、死亡和細(xì)胞內(nèi)活性氧水平;檢測肝臟組織學(xué)變化、肝酶、細(xì)胞凋亡等指標(biāo);基因芯片檢測二甲雙胍聯(lián)合三氧化二砷處理后AML12細(xì)胞基因表達(dá)譜變化,seahorse系統(tǒng)檢測細(xì)胞糖代謝變化。低糖或魚藤酮處理AML12細(xì)胞后,檢測細(xì)胞凋亡、死亡和細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。結(jié)果1.二甲雙胍和三氧化二砷協(xié)同抑制肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞增殖;二甲雙胍聯(lián)合三氧化二砷有效抑制肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞裸鼠移植瘤增殖。2.二甲雙胍聯(lián)合三氧化二砷可能通過抑制mTORCl的活性來抑制膽管細(xì)胞癌增殖。二甲雙胍可抑制三氧化二砷引起的p38MAPK的活化,下調(diào)或者抑制p38MAPK可以增強(qiáng)二甲雙胍聯(lián)合三氧化二砷抑制肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞的作用,二甲雙胍和三氧化二砷能通過激活A(yù)MPK上調(diào)ERK3蛋白的表達(dá),ERK3可以抑制mTORC1的活化。激活A(yù)MPK可抑制p38MAPK,上調(diào)ERK3表達(dá)。腫瘤組織中ERK3蛋白低表達(dá)是肝內(nèi)膽管癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。3.二甲雙胍抑制三氧化二砷誘導(dǎo)的AML12細(xì)胞凋亡,減輕三氧化二砷引起的小鼠肝損傷。調(diào)控葡萄糖代謝可能是二甲雙胍對三氧化二砷處理的AML12細(xì)胞的發(fā)揮保護(hù)作用的關(guān)鍵機(jī)制。低糖處理或魚藤酮可有效緩解三氧化二砷誘導(dǎo)AML12細(xì)胞凋亡性壞死。對線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ的抑制作用介導(dǎo)了二甲雙胍對三氧化二砷誘導(dǎo)的AML12細(xì)胞凋亡性壞死的保護(hù)作用。二甲雙胍增加AML12細(xì)胞內(nèi)NADH/NAD+比例。結(jié)論1.二甲雙胍聯(lián)合三氧化二砷具有協(xié)同抑制肝內(nèi)膽管癌的作用,該作用可能與兩藥可共同促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期,促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS升高,誘導(dǎo)肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞凋亡有關(guān)。2.二甲雙胍和三氧化二砷可通過AMPK/p38 MAPK-ERK3/mTORC1通路在體內(nèi)和體外抑制肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞增殖。腫瘤組織中ERK3蛋白低表達(dá)是肝內(nèi)膽管癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。p38MAPK的活性和E)RK3蛋白的表達(dá)可能與肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞對二甲雙胍和三氧化二砷的敏感性有關(guān)。3.二甲雙胍可有效減輕三氧化二砷引起的肝細(xì)胞損傷,其可能通過抑制粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ,提高肝細(xì)胞內(nèi)NADH/NAD+比率,進(jìn)而抑制三氧化二砷誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS水平,抑制細(xì)胞凋亡性壞死。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.8
【部分圖文】：

３．１二甲雙胍和三氧化二砷協(xié)同抑制肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞增殖逡逑使用ＲＴＣＡ系統(tǒng)實(shí)時(shí)檢測細(xì)胞增殖，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍（１０邋ｍＭ）聯(lián)合三氧化二逡逑砷（３邋ｐｍｏｌ／Ｌ）較對照組和單藥組比，明顯抑制肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞增殖（圖３．１Ａ）。逡逑ＣＣＫ－８檢測細(xì)胞藥物抑制細(xì)胞增殖，計(jì)算得到ＣＩ指數(shù)，當(dāng)抑制率大于５０％，二甲逡逑雙胍聯(lián)合三氧化二砷在三種膽管癌細(xì)胞中，ＣＩ指數(shù)都小于１，即有協(xié)同抑制作用逡逑（圖邋３．１Ｂ，表邋２）。逡逑Ａ邋邐邐嚴(yán)＿＿Ｓ？Ｌ，Ｐ：１邋邐邐邐邋—邋Ｃｏｎｔｒｏｌ邐Ｂ邋，邐ＣＣＬＰ－１逡逑；；一＾山１邋丨１１１＾＾＾＊邐￣￣￣￣￣邋Ｓ＂，？一—，＊邐＃邋邐邐逡逑ｔ？邐？＊３邐Ｈｉ邐＊？邐Ｂｌ邐？Ｓ邐Ｕ：邐＊ＳＩ邐Ｕｌ邐Ｖｆｌ邐？邐Ｑ．２Ｓ邐ｆｔ｝邐０．７Ｓ邐Ｉ逡逑Ｃｏｍｂｉｎｅｄ邋ａｎｔｉ－ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ邋ｅｆｆｅｃｔ逡逑，邐ｔ邐ＲＢＥ逡逑ｉ邋？邐＾邐：逡逑ＩＳ邐？ｔ邐ＨＩ邐Ｘ：邐ｍｔ邐ｍ邐Ｅ：邐－ｒｉ邐Ｂ＞邐？？：邐Ｑ邐？？邐（Ｌｊ邐０．ＪＳ邐１逡逑Ｃｏｍｂｉｎｅｄ邋ａｎｔｉ－ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ邋ｅｆｆｅｃｔ逡逑ＨＣＣＣ－９８１０邐ＨＣＣＣ－９８１０逡逑ｔｔ邐ｍ邐ｎａ邐�。裕哼姡酰暨姡酰窟姡恚暹姡瑁檫姡耄具姟觯姡尺姡铮徇姡猓妫檫姡幔钸姡卞义希裕ⅲ簦铮н姡茫铮恚猓椋睿澹溴澹幔睿簦椋穑颍铮欤椋妫澹颍幔簦椋觯邋澹澹妫妫澹悖翦义蠄D３．１二甲雙胍和三氧化二砷協(xié)同抑制肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞增殖逡逑圖注：Ａ二f袼遙ǎ保埃恚停┝先躉椋ǎ辰校睿錚歟蹋┐砣指文詰ü苠義習(xí)┫赴罰殘∈

本文編號：2815599