非小細(xì)胞肺癌和食管癌是我國最常見胸部惡性腫瘤,其發(fā)病率呈上升趨勢,而胸部腫瘤死亡病例約占了惡性腫瘤相關(guān)死亡病例的1/3。本研究擬探討iEESI-MS在快速區(qū)分胸部常見惡性腫瘤的癌組織及配對癌旁正常組織的應(yīng)用價值,并探索其差異性離子在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)意義。1.內(nèi)部萃取電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)在快速區(qū)分NSCLC組織中的實驗研究目的:探討內(nèi)部萃取電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)(iEESI-MS)在快速區(qū)分配對肺癌組織及癌旁正常肺組織中的應(yīng)用價值,研究磷脂類物質(zhì)差異性表達在肺癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)意義。方法:采用自主設(shè)計的自制精密取樣器及自主開發(fā)的iEESI-MS在無需預(yù)處理的情況下對我院納入研究的51例配對肺癌組織和癌旁正常肺組織進行分析;設(shè)置iEESI-MS離子源為正離子模式,質(zhì)譜掃描范圍設(shè)置為m/z 50-2000 Da;電離電壓為+4.5 k V;離子傳輸管溫度設(shè)置為150℃;離子傳輸管電壓設(shè)置為35 V;透鏡電壓設(shè)置為100 V;其它質(zhì)譜參數(shù)均由LTQ-MS系統(tǒng)自動優(yōu)化;萃取劑為水/甲醇/乙酸(35:65:0.01,v/v/v),流速為0.5μL/min。在Matlab軟件對獲得樣本iEESI-MS質(zhì)譜指紋圖譜數(shù)據(jù)進行PLS計算分析得到區(qū)分結(jié)果。差異性離子相對豐度用SPSS 21.0進行比較。結(jié)果:本方法能在1min內(nèi)完成取樣、質(zhì)譜指紋數(shù)據(jù)獲得及分析;肺癌組織一級質(zhì)譜指紋譜圖主要離子為m/z 154.00,m/z 188.14,m/z 301.19,m/z 317.14,m/z 772.65,m/z 782.72,m/z 798.67,m/z 824.70,m/z 848.70;而癌旁正常肺組織一級質(zhì)譜指紋譜圖主要離子為m/z 158.16,m/z 227.26,m/z 274.41,m/z 318.45,m/z 518.56,m/z 728.76,m/z 756.80,m/z 782.76,m/z 804.72,m/z 832.76。經(jīng)過PLS分析,兩組樣本的質(zhì)譜指紋圖譜數(shù)據(jù)能夠明顯區(qū)分,且發(fā)現(xiàn)對于區(qū)分兩組樣本的主要差異性離子為m/z 706,m/z 757,m/z 773,m/z 783,m/z 799。比較發(fā)現(xiàn)肺癌組織中m/z 706,m/z 773,m/z 783,m/z 799明顯高于正常組織,而正常組織中m/z 757的相對豐度明顯高于癌組織(P0.05)。運用CID實驗,差異性離子m/z 757,m/z 773,m/z 783,m/z 799被鑒別為二棕櫚磷脂酰膽堿+鈉離子(DPPC+Na+),二棕櫚磷脂酰膽堿+鉀離子(DPPC+K+),鞘磷脂+氫離子(SM+H+),磷脂酰甘油+氫離子(PG+H+)。結(jié)論:內(nèi)部萃取電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)(iEESI-MS)耦合PLS能夠快速區(qū)分肺癌組織及癌旁正常肺組織,有望成為術(shù)中快速區(qū)分肺癌組織的新方法,并為探索NSCLC的磷脂類物質(zhì)代謝組學(xué)提供新方向。2.內(nèi)部萃取電噴霧電離質(zhì)譜法在快速區(qū)分食管癌組織中的實驗研究目的:探討內(nèi)部萃取電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)(iEESI-MS)在快速區(qū)分配對食管癌組織及癌旁正常食管組織中的應(yīng)用價值,探討氨基酸類物質(zhì)差異性表達的食管癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)意義。方法:采用自主設(shè)計的自制精密取樣器及自主開發(fā)的iEESI-MS在無預(yù)處理的情況下對我院納入研究的32例配對食管癌組織及正常食管樣本進行分析;設(shè)置iEESI-MS離子源為正離子模式,質(zhì)譜掃描范圍m/z 50-300 Da;電離電壓為+4.5k V;離子傳輸管溫度為150℃;離子傳輸管電壓為35 V;透鏡電壓為100 V;其它質(zhì)譜參數(shù)均由LTQ-MS系統(tǒng)自動優(yōu)化;萃取劑為水:甲醇:乙酸溶液(50:50:0.01,v/v/v),流速為0.5μL/min。用Matlab軟件對獲得樣本iEESI-MS質(zhì)譜指紋圖譜數(shù)據(jù)進行PLS計算分析得到區(qū)分結(jié)果,用SPSS 21.0對差異性離子相對豐度進行比較及評估其對區(qū)分的有效性。結(jié)果:本方法能在1min內(nèi)完成取樣、質(zhì)譜指紋數(shù)據(jù)獲得及分析;食管癌組織一級質(zhì)譜指紋圖譜主要離子為m/z 56.97、m/z 104.13、m/z 116.10、m/z 132.13、m/z147.16、m/z 154.06、m/z 156.08、m/z 175.13等,而正常食管組織主要以m/z 58.96、m/z 74.03、m/z 82.99、m/z 133.11、m/z 138.03、m/z147.09、m/z 154.06、m/z 175.12、m/z 188.05等離子為主。經(jīng)過PLS分析,兩組樣本的質(zhì)譜指紋圖譜數(shù)據(jù)能夠明顯區(qū)分,比較發(fā)現(xiàn)在食管癌組織中m/z 104.13、m/z 116.10、m/z 132.13和m/z175.13明顯高于正常組織,而正常食管組織中m/z 82.99、m/z 133.11、m/z147.08、m/z154.06和m/z 188.05的相對豐度明顯高于癌組織(P0.05);運用CID實驗,鑒別差異性離子m/z104.13為二甲基甘氨酸,m/z116.10為脯氨酸,m/z132.13為異亮氨酸,m/z133.11為天冬酰胺,m/z147.08為谷氨酰胺,而m/z175.13為精氨酸。運用ROC曲線對差異性物質(zhì)進行區(qū)分有效性的評估,發(fā)現(xiàn)二甲基甘氨酸(DMG)、脯氨酸、異亮氨酸、精氨酸對于區(qū)分兩組樣本的有效性優(yōu)于天冬酰胺和谷氨酰胺。結(jié)論:內(nèi)部萃取電噴霧電離質(zhì)譜法(iEESI-MS)耦合PLS分析能夠基于氨基酸類物質(zhì)差異表達快速區(qū)分食管癌及癌旁正常組織,為術(shù)中快速區(qū)分食管癌組織提供了新方法,為食管癌氨基酸代謝的研究提供了新方向。
【學(xué)位單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.1;R734.2
【部分圖文】：

實驗步驟驗參數(shù)優(yōu)化建 iEESI-MS 離子源裝置，用自制精密取樣器取樣并優(yōu)化各實驗參數(shù)，構(gòu)見圖 1。優(yōu)化參數(shù)時利用控制變量法，只調(diào)節(jié) 1 個參數(shù)，且同一個參過程用同一樣本（正常肺組織）并在同一次實驗內(nèi)完成。建好 iEESI-MS 離子源后，不放置組織樣品，將取樣器樣本出口離質(zhì)譜離調(diào)節(jié)為 5 mm，固定實驗裝置，避免距離變動；根據(jù)前期實驗組織噴譜實驗結(jié)果，選擇初始萃取劑為純甲醇，流速 0.4ul/min；設(shè)置離子掃正離子模式，離子掃描質(zhì)量范圍 50～2000 Da；離子傳輸管溫度設(shè)置，離子傳輸管電壓設(shè)置為 35 V，透鏡電壓設(shè)置為 100 V，其他條件 LTQ-動優(yōu)化。首先，進樣萃取劑用于檢測質(zhì)譜儀的清潔狀況及運行狀態(tài)，開檢查是否有信號干擾，如有雜質(zhì)信號干擾，則清洗離子源及質(zhì)譜儀口，步驟至無干擾信號。

第二章 內(nèi)部萃取電噴霧電離質(zhì)譜分析技術(shù)參數(shù)優(yōu)化及實驗步驟用自制精密取樣器切取樣本并上樣，調(diào)節(jié)不同離子模式（正離子模式子模式，每種離子模式最少持續(xù)掃描 2 分鐘以上），經(jīng)過重復(fù)試驗，得到組織樣品在不同離子模式下的典型質(zhì)譜指紋圖譜（圖 2），可見正離子模得到更為豐富的組織樣品質(zhì)譜指紋，故離子掃描方式確定為正離子模式。

圖 3 信號強度與電噴霧電壓的關(guān)系注：圖中數(shù)據(jù)均只取離子強度等級2.1.3 取樣器樣本出口與質(zhì)譜入口的距離的確定如圖 4 所示，根據(jù) iEESI-MS 的原理，樣本形成的電噴霧進入質(zhì)譜儀才能檢測到信號，且存在樣本出口與質(zhì)譜口的最佳距離能夠得到穩(wěn)定的譜圖，在前期研究的基礎(chǔ)上，此距離的優(yōu)化范圍我們設(shè)定為 3～12mm；在其他參數(shù)不變的的條件才下，從 3mm 調(diào)節(jié)至 12mm，每次距離遞增 1mm，每一距離持續(xù)掃描 2 分鐘，根據(jù)實驗結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)隨著取樣器樣本出口與質(zhì)譜入口的距離增大，質(zhì)譜信號強度先增強而減弱，3～5mm 變化時逐漸增強，當(dāng)距離為 5mm 時所捕獲的質(zhì)譜指紋譜圖信號強且穩(wěn)定，5～12mm 變化時質(zhì)譜指紋譜圖信號強度由于距離的增加出現(xiàn)減弱趨勢。故本研究將樣本與質(zhì)譜口距離設(shè)定為 5mm。

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本文編號：2811827