發(fā)布時(shí)間：2020-09-03 18:50

　　 非小細(xì)胞肺癌和食管癌是我國(guó)最常見(jiàn)胸部惡性腫瘤,其發(fā)病率呈上升趨勢(shì),而胸部腫瘤死亡病例約占了惡性腫瘤相關(guān)死亡病例的1/3。本研究擬探討iEESI-MS在快速區(qū)分胸部常見(jiàn)惡性腫瘤的癌組織及配對(duì)癌旁正常組織的應(yīng)用價(jià)值,并探索其差異性離子在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)意義。1.內(nèi)部萃取電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)在快速區(qū)分NSCLC組織中的實(shí)驗(yàn)研究目的:探討內(nèi)部萃取電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)(iEESI-MS)在快速區(qū)分配對(duì)肺癌組織及癌旁正常肺組織中的應(yīng)用價(jià)值,研究磷脂類(lèi)物質(zhì)差異性表達(dá)在肺癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)意義。方法:采用自主設(shè)計(jì)的自制精密取樣器及自主開(kāi)發(fā)的iEESI-MS在無(wú)需預(yù)處理的情況下對(duì)我院納入研究的51例配對(duì)肺癌組織和癌旁正常肺組織進(jìn)行分析;設(shè)置iEESI-MS離子源為正離子模式,質(zhì)譜掃描范圍設(shè)置為m/z 50-2000 Da;電離電壓為+4.5 k V;離子傳輸管溫度設(shè)置為150℃;離子傳輸管電壓設(shè)置為35 V;透鏡電壓設(shè)置為100 V;其它質(zhì)譜參數(shù)均由LTQ-MS系統(tǒng)自動(dòng)優(yōu)化;萃取劑為水/甲醇/乙酸(35:65:0.01,v/v/v),流速為0.5μL/min。在Matlab軟件對(duì)獲得樣本iEESI-MS質(zhì)譜指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行PLS計(jì)算分析得到區(qū)分結(jié)果。差異性離子相對(duì)豐度用SPSS 21.0進(jìn)行比較。結(jié)果:本方法能在1min內(nèi)完成取樣、質(zhì)譜指紋數(shù)據(jù)獲得及分析;肺癌組織一級(jí)質(zhì)譜指紋譜圖主要離子為m/z 154.00,m/z 188.14,m/z 301.19,m/z 317.14,m/z 772.65,m/z 782.72,m/z 798.67,m/z 824.70,m/z 848.70;而癌旁正常肺組織一級(jí)質(zhì)譜指紋譜圖主要離子為m/z 158.16,m/z 227.26,m/z 274.41,m/z 318.45,m/z 518.56,m/z 728.76,m/z 756.80,m/z 782.76,m/z 804.72,m/z 832.76。經(jīng)過(guò)PLS分析,兩組樣本的質(zhì)譜指紋圖譜數(shù)據(jù)能夠明顯區(qū)分,且發(fā)現(xiàn)對(duì)于區(qū)分兩組樣本的主要差異性離子為m/z 706,m/z 757,m/z 773,m/z 783,m/z 799。比較發(fā)現(xiàn)肺癌組織中m/z 706,m/z 773,m/z 783,m/z 799明顯高于正常組織,而正常組織中m/z 757的相對(duì)豐度明顯高于癌組織(P0.05)。運(yùn)用CID實(shí)驗(yàn),差異性離子m/z 757,m/z 773,m/z 783,m/z 799被鑒別為二棕櫚磷脂酰膽堿+鈉離子(DPPC+Na+),二棕櫚磷脂酰膽堿+鉀離子(DPPC+K+),鞘磷脂+氫離子(SM+H+),磷脂酰甘油+氫離子(PG+H+)。結(jié)論:內(nèi)部萃取電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)(iEESI-MS)耦合PLS能夠快速區(qū)分肺癌組織及癌旁正常肺組織,有望成為術(shù)中快速區(qū)分肺癌組織的新方法,并為探索NSCLC的磷脂類(lèi)物質(zhì)代謝組學(xué)提供新方向。2.內(nèi)部萃取電噴霧電離質(zhì)譜法在快速區(qū)分食管癌組織中的實(shí)驗(yàn)研究目的:探討內(nèi)部萃取電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)(iEESI-MS)在快速區(qū)分配對(duì)食管癌組織及癌旁正常食管組織中的應(yīng)用價(jià)值,探討氨基酸類(lèi)物質(zhì)差異性表達(dá)的食管癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)意義。方法:采用自主設(shè)計(jì)的自制精密取樣器及自主開(kāi)發(fā)的iEESI-MS在無(wú)預(yù)處理的情況下對(duì)我院納入研究的32例配對(duì)食管癌組織及正常食管樣本進(jìn)行分析;設(shè)置iEESI-MS離子源為正離子模式,質(zhì)譜掃描范圍m/z 50-300 Da;電離電壓為+4.5k V;離子傳輸管溫度為150℃;離子傳輸管電壓為35 V;透鏡電壓為100 V;其它質(zhì)譜參數(shù)均由LTQ-MS系統(tǒng)自動(dòng)優(yōu)化;萃取劑為水:甲醇:乙酸溶液(50:50:0.01,v/v/v),流速為0.5μL/min。用Matlab軟件對(duì)獲得樣本iEESI-MS質(zhì)譜指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行PLS計(jì)算分析得到區(qū)分結(jié)果,用SPSS 21.0對(duì)差異性離子相對(duì)豐度進(jìn)行比較及評(píng)估其對(duì)區(qū)分的有效性。結(jié)果:本方法能在1min內(nèi)完成取樣、質(zhì)譜指紋數(shù)據(jù)獲得及分析;食管癌組織一級(jí)質(zhì)譜指紋圖譜主要離子為m/z 56.97、m/z 104.13、m/z 116.10、m/z 132.13、m/z147.16、m/z 154.06、m/z 156.08、m/z 175.13等,而正常食管組織主要以m/z 58.96、m/z 74.03、m/z 82.99、m/z 133.11、m/z 138.03、m/z147.09、m/z 154.06、m/z 175.12、m/z 188.05等離子為主。經(jīng)過(guò)PLS分析,兩組樣本的質(zhì)譜指紋圖譜數(shù)據(jù)能夠明顯區(qū)分,比較發(fā)現(xiàn)在食管癌組織中m/z 104.13、m/z 116.10、m/z 132.13和m/z175.13明顯高于正常組織,而正常食管組織中m/z 82.99、m/z 133.11、m/z147.08、m/z154.06和m/z 188.05的相對(duì)豐度明顯高于癌組織(P0.05);運(yùn)用CID實(shí)驗(yàn),鑒別差異性離子m/z104.13為二甲基甘氨酸,m/z116.10為脯氨酸,m/z132.13為異亮氨酸,m/z133.11為天冬酰胺,m/z147.08為谷氨酰胺,而m/z175.13為精氨酸。運(yùn)用ROC曲線(xiàn)對(duì)差異性物質(zhì)進(jìn)行區(qū)分有效性的評(píng)估,發(fā)現(xiàn)二甲基甘氨酸(DMG)、脯氨酸、異亮氨酸、精氨酸對(duì)于區(qū)分兩組樣本的有效性?xún)?yōu)于天冬酰胺和谷氨酰胺。結(jié)論:內(nèi)部萃取電噴霧電離質(zhì)譜法(iEESI-MS)耦合PLS分析能夠基于氨基酸類(lèi)物質(zhì)差異表達(dá)快速區(qū)分食管癌及癌旁正常組織,為術(shù)中快速區(qū)分食管癌組織提供了新方法,為食管癌氨基酸代謝的研究提供了新方向。
【學(xué)位單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R735.1;R734.2
【部分圖文】：

實(shí)驗(yàn)步驟驗(yàn)參數(shù)優(yōu)化建 iEESI-MS 離子源裝置，用自制精密取樣器取樣并優(yōu)化各實(shí)驗(yàn)參數(shù)，構(gòu)見(jiàn)圖 1。優(yōu)化參數(shù)時(shí)利用控制變量法，只調(diào)節(jié) 1 個(gè)參數(shù)，且同一個(gè)參過(guò)程用同一樣本（正常肺組織）并在同一次實(shí)驗(yàn)內(nèi)完成。建好 iEESI-MS 離子源后，不放置組織樣品，將取樣器樣本出口離質(zhì)譜離調(diào)節(jié)為 5 mm，固定實(shí)驗(yàn)裝置，避免距離變動(dòng)；根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)組織噴譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇初始萃取劑為純甲醇，流速 0.4ul/min；設(shè)置離子掃正離子模式，離子掃描質(zhì)量范圍 50～2000 Da；離子傳輸管溫度設(shè)置，離子傳輸管電壓設(shè)置為 35 V，透鏡電壓設(shè)置為 100 V，其他條件 LTQ-動(dòng)優(yōu)化。首先，進(jìn)樣萃取劑用于檢測(cè)質(zhì)譜儀的清潔狀況及運(yùn)行狀態(tài)，開(kāi)檢查是否有信號(hào)干擾，如有雜質(zhì)信號(hào)干擾，則清洗離子源及質(zhì)譜儀口，步驟至無(wú)干擾信號(hào)。

第二章 內(nèi)部萃取電噴霧電離質(zhì)譜分析技術(shù)參數(shù)優(yōu)化及實(shí)驗(yàn)步驟用自制精密取樣器切取樣本并上樣，調(diào)節(jié)不同離子模式（正離子模式子模式，每種離子模式最少持續(xù)掃描 2 分鐘以上），經(jīng)過(guò)重復(fù)試驗(yàn)，得到組織樣品在不同離子模式下的典型質(zhì)譜指紋圖譜（圖 2），可見(jiàn)正離子模得到更為豐富的組織樣品質(zhì)譜指紋，故離子掃描方式確定為正離子模式。

圖 3 信號(hào)強(qiáng)度與電噴霧電壓的關(guān)系注：圖中數(shù)據(jù)均只取離子強(qiáng)度等級(jí)2.1.3 取樣器樣本出口與質(zhì)譜入口的距離的確定如圖 4 所示，根據(jù) iEESI-MS 的原理，樣本形成的電噴霧進(jìn)入質(zhì)譜儀才能檢測(cè)到信號(hào)，且存在樣本出口與質(zhì)譜口的最佳距離能夠得到穩(wěn)定的譜圖，在前期研究的基礎(chǔ)上，此距離的優(yōu)化范圍我們?cè)O(shè)定為 3～12mm；在其他參數(shù)不變的的條件才下，從 3mm 調(diào)節(jié)至 12mm，每次距離遞增 1mm，每一距離持續(xù)掃描 2 分鐘，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)隨著取樣器樣本出口與質(zhì)譜入口的距離增大，質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度先增強(qiáng)而減弱，3～5mm 變化時(shí)逐漸增強(qiáng)，當(dāng)距離為 5mm 時(shí)所捕獲的質(zhì)譜指紋譜圖信號(hào)強(qiáng)且穩(wěn)定，5～12mm 變化時(shí)質(zhì)譜指紋譜圖信號(hào)強(qiáng)度由于距離的增加出現(xiàn)減弱趨勢(shì)。故本研究將樣本與質(zhì)譜口距離設(shè)定為 5mm。

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本文編號(hào)：2811827