發(fā)布時間：2020-08-29 09:13

　　 目的:膀胱腫瘤是泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤,復(fù)發(fā)率高,多數(shù)患者死于不同程度的膀胱腫瘤轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā),對該腫瘤的研究引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。Yes相關(guān)蛋白1(Yes-associated protein1,YAP1)作為癌基因,在抑制細(xì)胞凋亡、喪失細(xì)胞接觸抑制、促進(jìn)細(xì)胞異常增殖及細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化等方面發(fā)揮重要作用。目前在多種腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)YAP1呈高表達(dá)狀態(tài),并被認(rèn)為有望成為腫瘤早期診斷的分子標(biāo)志物及腫瘤治療的潛在靶點,但其對膀胱癌細(xì)胞的作用研究文獻(xiàn)報道尚較少。因此本研究擬觀察YAP1在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的作用,并探討其作用機制。方法:采用真核轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pGreenPuro構(gòu)建針對YAP1基因的重組轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。將4種不同序列的YAP1 shRNA質(zhì)粒以及含與YAP1無關(guān)序列的YAP1 shRNA NC分別轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞,48 h后qPCR檢測其YAP1表達(dá)水平,篩選YAP1基因沉默效果最好的shRNA質(zhì)粒干預(yù)T24細(xì)胞;使用MTT檢測shRNA質(zhì)粒對T24細(xì)胞增殖能力的影響、劃痕實驗檢測其對遷移能力的影響、Transwell小室體外侵襲實驗檢測侵襲能力的影響。18只裸鼠構(gòu)建人膀胱癌裸鼠動物模型,然后分為 3 組:YAP1 shRNA3-pGreenPuro 組、Control-shRNA 組與生理鹽水組,每組6只。YAP1 shRNA3-pGreenPuro組腫瘤體內(nèi)分別多點注射YAP1 shRNA3-pGreenPuro重組質(zhì)粒,每只分別為50μg質(zhì)粒+400 μl 5%瓊脂糖+10 μl轉(zhuǎn)染試劑(轉(zhuǎn)染試劑配制參見說明書),ControlshRNA組和生理鹽水組分別為50μg陰性對照質(zhì)粒和50 μl滅菌生理鹽水。比較各組荷瘤裸鼠一般情況、毒副作用、抑瘤率,光學(xué)顯微鏡下觀察各組腫瘤組織病理學(xué),采用RT-PCR法檢測各組腫瘤組織YAP1 mRNA表達(dá)水平,采用western blot法檢測各組腫瘤組織YAP1及下游靶基因(IGF、Akt、Jag-1、TGF-β)蛋白表達(dá)。收集本院泌尿外科2015年2月～2017年10月期間采用手術(shù)切除治療的52例膀胱癌及癌旁組織標(biāo)本,同時收集40例膀胱炎癥組織標(biāo)本。采用免疫組織化學(xué)方法檢測膀胱癌組織、癌旁組織及膀胱炎癥組織YAP1蛋白表達(dá)水平,比較YAP1在膀胱癌組織、膀胱癌癌旁組織及膀胱炎癥組織中的表達(dá)水平,同時分析膀胱癌組織中YAP1表達(dá)水平與年齡、性別、組織學(xué)分級、腫瘤數(shù)目、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等臨床病理特征的相關(guān)性關(guān)系。結(jié)果:1.qPCR檢測T24細(xì)胞陽性表達(dá)YAP1基因,用Lipofectamine2000成功將不同YAP1shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入T24細(xì)胞；qPCR檢測發(fā)現(xiàn)YAP1shRNA3質(zhì)粒沉默T24細(xì)胞YAP1表達(dá)效果最顯著(抑制率75.5%),隨后用YAP1 shRNA3質(zhì)粒干擾T24細(xì)胞,MTT檢測顯示轉(zhuǎn)染YAP1 shRNA3質(zhì)粒組T24細(xì)胞增殖能力小于空白對照組(干擾組增殖率為空白對照組的85.9%,p0.01);轉(zhuǎn)染YAP1shRNA3的T24細(xì)胞遷移能力較空白對照組低(24小時劃痕寬度分別為220 μm和80μm,p0.01);轉(zhuǎn)染YAP1shRNA3的T24細(xì)胞侵襲能力較空白對照組弱(穿透 Transwell 小室的平均細(xì)胞數(shù) 62:345,p0.01);2.YAP1 shRNA3-pGreenPuro組、Control-shRNA組及生理鹽水組裸鼠治療期間均存活,均有瘤體形成。各組裸鼠日常飲食未出現(xiàn)明顯變化,精神狀態(tài)較為良好,且體質(zhì)量未出現(xiàn)明顯減輕。各組裸鼠治療后血常規(guī)、肝腎功能比較無顯著性差異,且各組裸鼠心、肝、腎、脾等重要臟器均未出現(xiàn)明顯異常表現(xiàn);3.YAP1shRNA3-pGreenPuro組[(202.7±37.5)mm3]明顯小于 Control-shRNA 組[(792.4±46.7)mm3]和生理鹽水組[(798.6±50.2)mm3](P0.05)。YAP1 shRNA3-pGreenPuro組、Control-shRNA 組及生理鹽水組的抑瘤率分別為74.2%、3.7%、3.6%;4.光學(xué)顯微鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)Control-shRNA組和生理鹽水組腫瘤細(xì)胞生長良好,腫瘤細(xì)胞形態(tài)呈不規(guī)則表現(xiàn),可發(fā)現(xiàn)存在有較多的腫瘤細(xì)胞核分裂象,而YAP1 shRNA3-pGreenPuro組腫瘤生長受到明顯的抑制,腫瘤細(xì)胞核分裂象較Control-shRNA組和生理鹽水組明顯減少,且出現(xiàn)腫瘤壞死區(qū),其中細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失,存在細(xì)胞崩解碎片等表現(xiàn);5.YAP1 shRNA3-pGreenPuro 組 YAP1 mRNA 表達(dá)水平明顯低于 Control-shRNA 組和生理鹽水組(P0.05),而Control-shRNA組與生理鹽水組比較無顯著差異性(P0.05);6.YAP1 shRNA3-pGreenPuro組腫瘤組織YAP1及下游靶基因蛋白(IGF、Akt、Jag-1、TGF-β)表達(dá)水平均明顯低于Control-shRNA組和生理鹽水組(P0.05),而Control-shRNA組與生理鹽水組比較無顯著差異性(P0.05);7.膀胱癌組YAP1陽性表達(dá)率(80.77%,42/52)明顯高于膀胱癌癌旁組(46.15%,24/52)和膀胱炎癥組(20.0%,8/40)(P0.05),而膀胱癌癌旁組(46.15%,24/52)明顯高于膀胱炎癥組(20.0%,8/40)(P0.05);8.YAP1表達(dá)水平與膀胱癌患者年齡、性別、組織學(xué)分級、腫瘤數(shù)目無明顯相關(guān)性關(guān)系(P0.05),而與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有明顯相關(guān)性關(guān)系(P0.05)。結(jié)論:YAP1 shRNA3-pGreenPuro能明顯降低人膀胱癌T24細(xì)胞內(nèi)的YAP1基因表達(dá),并抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,通過降低腫瘤組織YAP1及下游靶基因蛋白(IGF、Akt、Jag-1、TGF-β)表達(dá)水平可明顯抑制人膀胱癌裸鼠腫瘤組織生長,此外還證實膀胱癌患者YAP1表達(dá)水平與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有明顯相關(guān)性關(guān)系(P0.05),可作為預(yù)測膀胱癌病情及治療的新靶點。
【學(xué)位單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R737.14
【部分圖文】：

注：１－３、５－８邋為邋ｓｈＲＮＡ－ｌ邋陽性克�。唬梗保�、１４、１５邋為邋ｓｈＲＮＡ－２邋陽性克��；１７、１８、２１－２３逡逑為ｓｈＲＮＡ－３陽性克��；２５－３２為ｓｈＲＮＡ－ＮＣ陽性克隆逡逑圖１．２邋ＹＡＰｌ－ｓｈＲＮＡ－ｐＧｒｅｅｎＰｕｒｏ重組質(zhì)粒陽性克隆鑒定圖逡逑３．３測序證實逡逑將搖菌產(chǎn)物每組挑選３個克隆，送蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測序，逡逑１３逡逑

３．４邋ＹＡＰｌ－ｓｈＲＮＡ－ｐＧｒｅｅｎＰｕｒｏ質(zhì)粒干擾效果檢測逡逑將ＹＡＰｌ－ｓｈＲＮＡ－ｐＧｒｅｅｎＰｕｒｏ重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Ｔ２４細(xì)胞，用實時定量反轉(zhuǎn)錄逡逑聚合酶鏈反應(yīng)（ＲＴ－ｑＰＣＲ）鑒定干擾質(zhì)粒對Ｔ２４細(xì)胞ＹＡＰ１基因的沉默效果，結(jié)果逡逑顯示４種ＹＡＰｌｓｈＲＮＡ質(zhì)粒均能有效沉默ＹＡＰ１基因的表達(dá)（抑制率分別為３７．４％，逡逑５１．８％，７５．５％和５０．５％），其中ＹＡＰ１邋ｓｈＲＮＡ３質(zhì)粒沉默Ｔ２４細(xì)胞ＹＡＰ１表達(dá)效果逡逑最顯著（尸＜０．０５），詳見圖１．４。逡逑

４８小時后ＭＴＴ結(jié)果顯示干擾組增殖率為空白對照組的８５．９％（Ｐ＜０．０５），逡逑提示ＹＡＰｌ邋ｓｈＲＮＡ３－ｐＧｒｅｅｎＰｕｒｏ重組質(zhì)粒能抑制Ｔ２４細(xì)胞的增殖，有統(tǒng)計學(xué)意義，逡逑詳見圖１．５。逡逑＾１０＇逡逑°－９＇邐上逡逑Ｍｇ逡逑思。逡逑Ａ，逡逑圖１．５邋ＹＡＰｌ－ｓｈＲＮＡ干擾質(zhì)粒對Ｔ２４細(xì)胞增殖能力的影響逡逑（注：與空白組比較，＊Ｐ＜０．０５）逡逑１５逡逑

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前7條

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本文編號：2808354