發(fā)布時(shí)間：2020-08-28 00:20

【摘要】：目的分子大汗腺型乳腺癌(molecular apocrine breast cancer,MABC)是近年來(lái)提出的一種新的乳腺癌分子亞型,其免疫表型特征是雌激素受體(estrogen receptor,ER)和孕激素受體(progesterone receptor,PR)表達(dá)陰性,而雄激素受體(androgen receptor,AR)表達(dá)陽(yáng)性。本研究分析MABC與相關(guān)臨床病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系以及MABC患者的臨床預(yù)后;探索AR和熱休克蛋白27(heat shock protein 27,HSP27)對(duì)MABC的影響及相關(guān)作用機(jī)制。方法1、隨機(jī)選取浸潤(rùn)性乳腺癌組織樣本500例,免疫組化法檢測(cè)ER,PR,AR,HSP27,人表皮生長(zhǎng)因子受體2(epidermal growth factor receptor 2,HER2)和Ki67的表達(dá)情況,根據(jù)ER,PR和AR的表達(dá)將所有樣本分為MABC組和非分子大汗腺型乳腺癌(nonMABC)組,分析HSP27與AR表達(dá)的相關(guān)性,以及MABC患者的預(yù)后。2、選取具有MABC表型的MDA-MB-453細(xì)胞系和具有nonMABC表型的MCF7細(xì)胞系,CCK8及平板克隆實(shí)驗(yàn)分析雄激素二氫睪酮(dihydrotestosterone,DHT)刺激AR活化和下調(diào)HSP27對(duì)MABC細(xì)胞增殖能力的影響;免疫熒光和Western blot分析AR和HSP27表達(dá)及定位;免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)檢測(cè)AR-HSP27復(fù)合物的形成。構(gòu)建HSP27磷酸化位點(diǎn)的突變體,包括15、78和82位絲氨酸,Western blot、實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)和免疫熒光檢測(cè)AR的表達(dá)及定位,分析影響AR入核的關(guān)鍵HSP27磷酸化位點(diǎn)。3、選取MABC和nonMABC樣本各205例,分析MABC患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的時(shí)間及部位、對(duì)術(shù)后放化療的敏感性;將MDA-MB-453細(xì)胞分為三組:HSP27下調(diào)組、DHT刺激組和對(duì)照組,將2×10~6細(xì)胞注射到雙免疫缺陷小鼠皮下脂肪墊,觀察腫瘤的形成及轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果1、MABC腫瘤有更高的組織學(xué)分級(jí)(P0.001)、腫瘤體積(P0.001)、病理學(xué)TNM分期(pTNM,P0.001)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率(P0.001);相對(duì)于nonMABC,HSP27在MABC中的陽(yáng)性表達(dá)率更高(P=0.013);MABC中,HSP27的表達(dá)與腫瘤組織學(xué)分級(jí)(P0.001)、腫瘤大小(P=0.044)、pTNM分期(P=0.046)、Ki67表達(dá)(P0.001)以及HER2表達(dá)(P0.001)有關(guān);此外,相對(duì)于nonMABC,MABC患者的無(wú)病生存率(Disease-free survival,DFS)和總生存率(Overall survival,OS)更低(P0.001),HSP27陽(yáng)性表達(dá)者有更差的DFS和OS(P=0.024,P=0.025)。2、選取MABC表型的MDA-MB-453細(xì)胞和nonMABC表型的MCF7細(xì)胞,檢測(cè)ER、PR和AR的表達(dá)情況,結(jié)果顯示MDA-MB-453細(xì)胞中ER和PR表達(dá)陰性、AR表達(dá)陽(yáng)性,MCF7細(xì)胞中ER、PR和AR均表達(dá)陽(yáng)性,符合本實(shí)驗(yàn)的要求;CCK8實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證DHT的最佳作用濃度為10^-8M且作用時(shí)間為48小時(shí);分別用碳處理血清或碳處理血清加DHT培養(yǎng)細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)DHT對(duì)MDA-MB-453細(xì)胞的增殖能力具有促進(jìn)作用,而對(duì)MCF7細(xì)胞具有抑制作用。3、DHT刺激能夠促進(jìn)MDA-MB-453和MCF7細(xì)胞中AR和pHSP27-S82蛋白的表達(dá),對(duì)HSP27總蛋白、pHSP27-S15和pHSP27-S78表達(dá)沒(méi)有影響;并且DHT能夠促進(jìn)AR基因的表達(dá),而對(duì)HSP27基因表達(dá)沒(méi)有影響。分別提取核漿蛋白,Western blot分析顯示DHT能夠誘導(dǎo)MDA-MB-453細(xì)胞中AR和HSP27在胞核中表達(dá)增多、胞漿中表達(dá)降低;MCF7細(xì)胞中,只有AR在胞核中表達(dá)增多、胞漿中表達(dá)降低,而HSP27沒(méi)有變化。4、提取總蛋白,Co-IP分析顯示DHT刺激后,MDA-MB-453和MCF7細(xì)胞中均有AR-HSP27復(fù)合物的存在;核漿蛋白分離提取,結(jié)果顯示MDA-MB-453細(xì)胞中AR-HSP27復(fù)合物存在于胞漿和胞核中,而MCF7細(xì)胞中僅在胞漿中能夠檢測(cè)到復(fù)合物。5、下調(diào)HSP27的表達(dá),MDA-MB-453細(xì)胞增殖能力降低,但這種效果可被DHT刺激所減弱,即HSP27下調(diào)和DHT刺激AR活化具有相反的作用;MCF7細(xì)胞中,HSP27的下調(diào)抑制細(xì)胞的增殖能力,DHT刺激后這種作用增強(qiáng),即HSP27下調(diào)和DHT刺激AR活化具有相同的作用。HSP27下調(diào)可同時(shí)減少AR蛋白的表達(dá),但是對(duì)AR基因表達(dá)沒(méi)有影響;并且HSP27下調(diào)能夠阻止MDA-MB-453和MCF7細(xì)胞中AR的入核。6、分別突變HSP27的三個(gè)磷酸化位點(diǎn),包括pHSP27-S15、pHSP27-S78和pHSP27-S82,Western blot和免疫熒光得出相同的結(jié)果:只有pHSP27-S82突變的細(xì)胞中,胞核內(nèi)AR的表達(dá)降低,即pHSP27-S82在AR入核過(guò)程中具有關(guān)鍵性的作用。7、相對(duì)于nonMABC,MABC患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的時(shí)間更早(P0.001),相關(guān)因素包括:腫瘤的組織學(xué)分級(jí)(P=0.003)、腫瘤大小(P=0.019)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率(P=0.035)、TNM分期(P=0.017)、以及HER2(P=0.033)、Ki67(P=0.044)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF;P=0.004)的表達(dá)狀態(tài)。MABC更傾向于發(fā)生肺(P=0.010)、肝(P=0.044)和腦(P=0.048)轉(zhuǎn)移,而nonMABC更傾向于發(fā)生骨轉(zhuǎn)移(P=0.012)。此外,接受術(shù)后放療加化療的nonMABC患者相對(duì)于只接受術(shù)后化療的患者有更好的無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率(Distant metastasis-free survival,DMFS;P=0.042)、DFS(P=0.005)和OS(P=0.017),而對(duì)MABC患者沒(méi)有顯著影響(P0.05)。8、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,DHT刺激AR活化后能夠增強(qiáng)MDA-MB-453細(xì)胞的成瘤能力、加快移植瘤生長(zhǎng)速度、誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生肝轉(zhuǎn)移;而HSP27下調(diào)能夠抑制移植瘤形成率及腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。DHT刺激AR活化后,移植瘤內(nèi)細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)、凋亡率降低;HSP27下調(diào)后,移植瘤細(xì)胞增殖能力減弱、凋亡率增加。結(jié)論MABC是一種具有高度惡性的腫瘤,HSP27的陽(yáng)性表達(dá)率高,患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的時(shí)間更早,生存期更短;AR和HSP27在誘導(dǎo)MABC惡性表型機(jī)制中發(fā)揮著重要作用;聯(lián)合AR和HSP27為治療靶點(diǎn)或許能為MABC患者選擇新的治療方案提供依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R737.9
【圖文】：

?1.1B）、HER2 的陽(yáng)性著色部位位于癌細(xì)胞胞膜（圖 1.1C）、Ki67 的陽(yáng)性著色部位位于癌細(xì)胞胞核（圖 1.1D）、AR 的陽(yáng)性著色部位位于癌細(xì)胞胞核（圖1.1E）、HSP27 的陽(yáng)性著色部位位于癌細(xì)胞胞漿（圖 1.1F）。根據(jù) ER、PR 和AR 的表達(dá)狀態(tài)，我們將所有的樣本分為兩個(gè)亞組，即 158 例 MABC 亞組（ER-PR-AR+）和 342 例 nonMABC 亞組，圖 1.2 展示了一組病例在組織學(xué)分類(lèi)歸屬于伴大汗腺分化的癌，而根據(jù)乳腺癌的分子分型屬于 MABC 亞型，即 ER和 PR 表達(dá)陰性，且 AR 表達(dá)陽(yáng)性。

士學(xué)位論文 一、AR 和 HSP27 對(duì) MABC 腫瘤影響的研究16圖1.2 組織學(xué)分類(lèi)歸屬于伴大汗腺分化的癌1例（A），免疫表型屬于MABC；AR表達(dá)陽(yáng)性（B），ER（C）和PR（D）表達(dá)陰性（原始放大倍數(shù)200×）a和b分別是ER和PR的正常乳腺組織的陽(yáng)性對(duì)照1.2.2 MABC 與 nonMABC 亞組中相關(guān)臨床病理學(xué)指標(biāo)之間的差異通過(guò)免疫組化結(jié)果分析得出 158 例浸潤(rùn)性乳腺癌樣本 ER 和 PR 表達(dá)陰性且AR 表達(dá)陽(yáng)性，歸類(lèi)于 MABC 亞組（31.6 %, 158/500），剩余的 342 例樣本歸類(lèi)于 nonMABC 亞組（68.4 %, 342/500）。在 MABC 亞組中，36.7 % (58/158)屬于HER2 過(guò)表達(dá)型乳腺癌，63.3 % (100/158)屬于 TNBC。相關(guān)的臨床病理學(xué)指標(biāo)與不同分子表型之間的差異在表 1.1 中顯示，即組織學(xué)級(jí)別高的腫瘤更常見(jiàn)于MABC 亞組（P<0.001）；相對(duì)于 nonMABC

天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文 一、AR 和 HSP27 對(duì) MABC 腫瘤影響的研究1.2.3 MABC與nonMABC的臨床預(yù)后在本研究所選取的病例樣本中，隨訪期間有 92 名患者發(fā)生了復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其中包括 54 例 MABC 患者和 38 例 nonMABC 患者。通過(guò)生存分析發(fā)現(xiàn)，MABC 相對(duì)于 nonMABC 患者的預(yù)后更差，MABC 患者的無(wú)病生存期及總生存期更短（P<0.001，圖 1.3A 和 1.3B）。

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