【摘要】：目的:緊密連接(tight junction,TJ)是癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中必須克服的首要屏障。癌細(xì)胞首先喪失細(xì)胞間連接,由原發(fā)灶解離,然后侵襲周圍組織。閉鎖小帶-1相關(guān)核酸結(jié)合蛋白(zonula occludens-1 associated nucleic acid binding protein,ZONAB)是重要的緊密連接蛋白,也是轉(zhuǎn)錄因子,細(xì)胞密度增加時ZONAB結(jié)合于閉鎖小帶-1(zonula occludens-1,ZO-1),處于未激活狀態(tài),ZONAB被激活后進(jìn)入細(xì)胞核,特異性地結(jié)合cyclinD1、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的啟動子,起到促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。在肝癌、結(jié)腸癌中ZONAB的表達(dá)上調(diào),發(fā)揮促進(jìn)癌細(xì)胞增殖的作用,但目前尚缺乏膀胱癌(bladder cancer,BC)中ZONAB表達(dá)情況的報道,雖然ZONAB作為轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用已被人們所知,而它能否影響腫瘤侵襲仍是未知數(shù)。本研究的目的是通過基因轉(zhuǎn)染、離體實(shí)驗(yàn)、在體實(shí)驗(yàn)等多種方法,檢測ZONAB在膀胱癌中的表達(dá)變異,并證明ZONAB表達(dá)對癌細(xì)胞侵襲力的影響,揭示膀胱癌侵襲的可能機(jī)制。研究方法:1、研究對象:選取患者為2014年至2016年之間于中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院醫(yī)院泌尿外科收治并接受手術(shù)治療,病理確診尿路上皮癌,排除不合并泌尿系感染病變,包括30例肌層浸潤性膀胱癌、41例非肌層浸潤性膀胱癌和相應(yīng)的癌旁非腫瘤組織(adjacent non-tumor tissue,ANTT)。研究樣本取自手術(shù)切除的腫瘤組織和癌旁組織,其中部分組織固定后行病理檢查及免疫組化實(shí)驗(yàn),部分組織轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中凍存。人尿路上皮永生細(xì)胞系sv-huc-1和膀胱尿路上皮癌細(xì)胞系5637、T24、UM-UC-3由中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫(上海)購得。2、ZONAB過表達(dá)T24多克隆細(xì)胞系構(gòu)建:在氨芐青霉素LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)pLV-ZONAB-DU及其對照組pLV-GFP-DU菌液,收集菌體提取質(zhì)粒,用紫外分光光度計測量OD260值,計算質(zhì)粒濃度,慢病毒載體、pH1、pH2轉(zhuǎn)染HET293T細(xì)胞,收集純化病毒,將慢病毒懸液加入有T24細(xì)胞生長的完全培養(yǎng)基,然后加入凝聚胺至終濃度,以此替換原細(xì)胞培養(yǎng)基,加入嘌呤霉素篩選細(xì)胞,14天后凍存細(xì)胞。3、用shRNA使ZONAB表達(dá)沉默:根據(jù)ZONAB基因序列設(shè)計合成shRNA序列,用大腸桿菌提取質(zhì)粒,慢病毒載體、pH1、pH2轉(zhuǎn)染HET293T細(xì)胞,收集純化病毒,用病毒感染UM-UC-3細(xì)胞,加入嘌呤霉素篩選細(xì)胞,14天后凍存細(xì)胞。4、Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn):將被稀釋的基質(zhì)膠加入transwell培養(yǎng)板上室,覆蓋聚碳酯膜,上室加入單細(xì)胞懸液。下室加入趨化因子液,1天后去除基質(zhì)膠和聚碳酯膜上表面的細(xì)胞。甲醇固定上室,蘇木素染色,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,切取聚碳酯膜,放置于載玻片,中性樹脂封片。在高倍鏡下計數(shù)細(xì)胞。5、動物模型的制備:將各組T24細(xì)胞于裸鼠的雙上肢腋下進(jìn)行皮下注射,記錄裸鼠瘤體各徑線。6、Westem blotting技術(shù):檢測膀胱組織、培養(yǎng)的各組細(xì)胞系中各種蛋白的表達(dá)水平。7、realtime-PCR技術(shù):檢測膀胱組織、培養(yǎng)的各組細(xì)胞系中各種mRNA表達(dá)水平。8、免疫組化技術(shù):觀察和檢測膀胱組織中各種蛋白的表達(dá)分布及強(qiáng)弱。9、HE染色:用于觀察實(shí)驗(yàn)動物模型中膀胱癌原發(fā)灶的浸潤情況。結(jié)果:一、膀胱癌中ZONAB的表達(dá)上調(diào)1、膀胱癌與癌旁非腫瘤組織中ZONAB mRNA的表達(dá):采用realtime-PCR檢測發(fā)現(xiàn)膀胱癌中ZONAB mRNA的表達(dá)較癌旁非腫瘤組織高。2、膀胱癌與癌旁非腫瘤組織中ZONAB蛋白的表達(dá):采用Western blotting發(fā)現(xiàn)膀胱癌中ZONAB蛋白的表達(dá)高于癌旁非腫瘤組織。3、膀胱癌與癌旁非腫瘤組織中ZONAB蛋白的免疫組化染色:通過免疫組化法檢測肌層浸潤性膀胱癌、非肌層浸潤性膀胱癌、癌旁組織中的ZONAB高表達(dá)率,發(fā)現(xiàn)膀胱癌中ZONAB高表達(dá)率高于癌旁組織,而且肌層浸潤性膀胱癌中ZONAB的高表達(dá)率高于非肌層浸潤性膀胱癌。4、膀胱癌中ZONAB蛋白表達(dá)與臨床病理因素的相關(guān)性:通過對免疫組化法測得膀胱癌中ZONAB蛋白的表達(dá)陽性率的分析,我們發(fā)現(xiàn)ZONAB蛋白的表達(dá)高表達(dá)率在不同年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移等臨床病理因素中均未表現(xiàn)出明顯差異。5、各種人尿路上皮細(xì)胞系中ZONAB mRNA的表達(dá):采用realtime-PCR檢測人膀胱癌細(xì)胞系5637、T24、UM-UC-3和人尿路上皮永生細(xì)胞系sv-huc-1中ZONAB mRNA的表達(dá),可見膀胱癌細(xì)胞系中ZONAB mRNA的表達(dá)較正常尿路上皮細(xì)胞系中的表達(dá)高。6、各細(xì)胞系中ZONAB蛋白的表達(dá):采用Western Blot法檢測人膀胱癌細(xì)胞系5637、T24、UM-UC-3和人尿路上皮永生細(xì)胞系sv-huc-1中ZONAB蛋白的表達(dá),可見膀胱癌細(xì)胞系中ZONAB蛋白的表達(dá)較正常尿路上皮細(xì)胞系中的表達(dá)高。二、ZONAB過表達(dá)的T24細(xì)胞系侵襲力增強(qiáng)1、ZONAB過表達(dá)的T24膀胱癌細(xì)胞系模型建立:通過慢病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人膀胱癌細(xì)胞系T24,用ZONAB表達(dá)載體pLV-ZONAB-DU包裝為ZONAB表達(dá)慢病毒,用表達(dá)ZONAB慢病毒分別感染T24細(xì)胞,篩選表達(dá)ZONAB的T24細(xì)胞株。通過Western blotting驗(yàn)證表達(dá)ZONAB的T24細(xì)胞系(T24-ZONAB)中ZONAB蛋白呈穩(wěn)定較高表達(dá)。2、不同ZONAB表達(dá)水平的T24膀胱癌細(xì)胞系的侵襲力檢測:通過Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)測得T24-P(空白對照)、T24-GFP(陰性對照)以及T24-ZONAB 3組細(xì)胞的侵襲率率。T24-ZONAB的侵襲率明顯高于對照組。三、ZONAB表達(dá)下調(diào)的UM-UC-3細(xì)胞系侵襲力減弱1、ZONAB表達(dá)下調(diào)的UM-UC-3膀胱癌細(xì)胞系模型建立:通過慢病毒載體shRNA轉(zhuǎn)染人膀胱癌細(xì)胞系UM-UC-3,篩選ZONAB表達(dá)下調(diào)的UM-UC-3細(xì)胞株。通過Western blotting驗(yàn)證ZONAB表達(dá)下調(diào)。2、不同ZONAB表達(dá)水平的UM-UC-3膀胱癌細(xì)胞系的侵襲力檢測:通過Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)測得UM-UC-3-P(空白對照)、UM-UC-3-N(陰性對照)以及UM-UC-3-R(實(shí)驗(yàn)組)3組細(xì)胞的侵襲率率。UM-UC-3-R的侵襲率明顯低于對照組。四、在體研究證實(shí)ZONAB表達(dá)促進(jìn)膀胱癌侵襲1、膀胱癌異種移植物動物模型:T24-ZONAB組腫瘤生長速度明顯高于T24-P及T24-GFP組,腫瘤直徑明顯大于其他兩組,提示ZONAB表達(dá)具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增值的作用。2、不同ZONAB表達(dá)水平的膀胱癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及侵襲檢測:小動物熒光成像發(fā)現(xiàn)T24-ZONAB裸鼠膀胱癌模型中腫瘤原發(fā)灶有明顯的熒光,提示膀胱癌原發(fā)灶有穩(wěn)定的ZONAB高表達(dá),但未發(fā)現(xiàn)明確的遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移灶。HE染色發(fā)現(xiàn)T24-P組與T24-GFP組腫瘤邊緣未發(fā)生周圍組織侵襲,而T24-ZONAB組原發(fā)灶周圍可見多處癌細(xì)胞橫紋肌侵襲,提示ZONAB表達(dá)有促進(jìn)腫瘤侵襲的功能。結(jié)論:1、膀胱癌中ZONAB表達(dá)上調(diào)。2、肌層浸潤性膀胱癌中ZONAB表達(dá)高于非肌層浸潤性膀胱癌。3、ZONAB表達(dá)有促進(jìn)腫瘤侵襲的作用。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.14
【圖文】：

ltime-PCR法檢測癌旁非腫瘤組織（ANTT）、膀胱癌（BC）中ONAB mRNA表達(dá)明顯高于癌旁組織。與內(nèi)參GAPDH表達(dá)進(jìn)行校標(biāo)準(zhǔn)化。以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表述，*表示P < 0.05，。癌旁非腫瘤組織中 ZONAB 蛋白的表達(dá)ernblot 法檢測癌旁非腫瘤組織與膀胱癌中 ZONAB 癌中 ZONAB 蛋白的表達(dá)高于癌旁非腫瘤組織，膀胱癌旁非腫瘤組織中表達(dá)表達(dá)量的 2.3 ± 0.4 倍（P <

法檢測癌旁非腫瘤組織與膀胱癌中 ZONAB 蛋白的表達(dá)（圖2），可見膀胱癌中 ZONAB 蛋白的表達(dá)高于癌旁非腫瘤組織，膀胱癌中 ZONAB 蛋白的表達(dá)量為癌旁非腫瘤組織中表達(dá)表達(dá)量的 2.3 ± 0.4 倍（P < 0.05）。圖 2，用 Western blotting 檢測癌旁非腫瘤組織（ANTT）、膀胱癌（BC）中 ZONAB 蛋白的表達(dá)。上圖為 2 例癌旁非腫瘤組織 N1 和 N2 和對應(yīng)的 2 例膀胱癌組織 T1 和 T2 中 ZONAB 蛋白

中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文的表達(dá)條帶。下圖為 ZONAB 的相對表達(dá)量柱狀圖。在膀胱癌中 ZONAB 蛋白表達(dá)明顯高于癌旁組織。與內(nèi)參 β -actin 表達(dá)進(jìn)行校正后的相對表達(dá)，并相對 ANTT 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表述，*表示 P < 0.05，t-檢驗(yàn)。每對組織重復(fù) 3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。3.3 膀胱癌與癌旁非腫瘤組織中 ZONAB 蛋白的免疫組化染色免疫組化染色測得癌旁非腫瘤組織和膀胱癌組織中的 ZONAB 蛋白表達(dá)，在癌旁正常組織中可見位于粘膜最上層的細(xì)胞膜深染，在膀胱癌組織中可見細(xì)胞核深染，證明膀胱癌中 ZONAB 蛋白脫離細(xì)胞膜緊密連接部位，進(jìn)入細(xì)胞核（圖 3）。膀胱癌組織中 ZONAB 高表達(dá)率為 38.0%（27/71），高于癌旁非腫瘤組織 19.7%（14/71）（P < 0.05）（圖 4）。

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本文編號：2806480