【摘要】：第一部分IFN-γ對肝癌細(xì)胞系表達(dá)galectin-9和EZH2的作用目的研究在IFN-γ刺激下肝癌細(xì)胞系中g(shù)alectin-9和EZH2表達(dá)情況方法使用重組人IFN-γ刺激Hep G2和Hep3B肝癌細(xì)胞系,模擬類似乙型病毒性肝炎相關(guān)肝癌中的高IFN-γ免疫微環(huán)境。在不同濃度IFN-γ刺激下和不同刺激時間下,使用免疫印跡法(western blot)和q PCR分別檢測Hep G2和Hep3B細(xì)胞中g(shù)alectin-9和EZH2蛋白和RNA水平的變化。在濃度梯度和時間梯度確定合適的IFN-γ濃度和刺激時間后,使用免疫熒光方法分別檢測Hep G2和Hep3B細(xì)胞中g(shù)alectin-9和EZH2的表達(dá),直觀顯示galectin-9和EZH2在IFN-γ刺激下的變化趨勢。結(jié)果在IFN-γ刺激下,galectin-9的表達(dá)明顯上調(diào),且呈明顯的濃度依賴性和時間依賴性。同時,我們發(fā)現(xiàn)EZH2的表達(dá)跟galectin-9呈現(xiàn)相同的趨勢。結(jié)論IFN-γ刺激下,肝癌細(xì)胞系Hep G2和Hep3B中g(shù)alectin-9和EZH2表達(dá)增加。第二部分EZH2通過mi R-22調(diào)控galectin-9在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)目的研究EZH2通過何種方式調(diào)控galectin-9在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)方法首先,我們從三條EZH2特異性的小干擾RNA中篩選出兩條EZH2敲低效果最明顯的用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在肝癌細(xì)胞系Hep G2和Hep3B中分別轉(zhuǎn)染這兩條si RNA后,分別使用western blot和q PCR檢測galectin-9在蛋白和RNA水平的變化。然后,構(gòu)建EZH2的過表達(dá)質(zhì)粒載體p CMV-EZH2,將其轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系Hep G2和Hep3B,驗(yàn)證過表達(dá)EZH2效果的同時,在蛋白和RNA水平檢測galectin-9的變化趨勢。最后,在使用IFN-γ刺激肝癌細(xì)胞系Hep G2和Hep3B的同時,轉(zhuǎn)染si EZH2,分別檢測EZH2敲低對IFN-γ誘導(dǎo)的galectin-9表達(dá)的影響。通過生物信息學(xué)方法預(yù)測可能在EZH2和galectin-9中起節(jié)點(diǎn)作用的mi RNA,構(gòu)建galectin-9 3’UTR區(qū)域的雙熒光素酶載體psi CHECK2-galectin-9,進(jìn)一步驗(yàn)證mi RNA對galectin-9的調(diào)控作用,并轉(zhuǎn)染相應(yīng)的mi RNA的類似物及抑制劑后檢測galectin-9蛋白水平的改變。確定調(diào)控galectin-9的mi RNA后,我們進(jìn)一步分別檢測了EZH2的過表達(dá)和敲低對該mi RNA表達(dá)的影響。從而證實(shí)EZH2通過該mi RNA間接調(diào)節(jié)galectin-9的表達(dá)。結(jié)果研究結(jié)果表明,使用si RNA敲低EZH2表達(dá)后,galectin-9表達(dá)在蛋白和RNA水平均明顯下調(diào)。而過表達(dá)EZH2后,galectin-9的表達(dá)則明顯上調(diào),而且敲低EZH2可部分阻斷IFN-γ誘導(dǎo)的galectin-9上調(diào)。生物信息學(xué)預(yù)測及后續(xù)驗(yàn)證表明mi R-22通過轉(zhuǎn)錄后途徑調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞中g(shù)alectin-9的表達(dá)。而肝癌組織及細(xì)胞系中EZH2均與mi R-22表達(dá)呈負(fù)相關(guān),過表達(dá)和敲低實(shí)驗(yàn)證實(shí)EZH2通過mi R-22間接調(diào)控galectin-9的表達(dá)。結(jié)論EZH2通過mi R-22間接調(diào)控galectin-9在肝癌細(xì)胞中表達(dá)。第三部分EZH2通過MIR22HG啟動子區(qū)域組蛋白甲基化抑制mi R-22表達(dá)目的研究EZH2抑制mi R-22表達(dá)的分子機(jī)制方法mi R-22在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)與其母基因MIR22HG類似,有研究表明mi R-22由MIR22HG轉(zhuǎn)錄后剪切加工而成。我們通過UCSC檢索MIR22HG的啟動子區(qū)域,發(fā)現(xiàn)一個長達(dá)858 bp的甲基化島。針對這一區(qū)域我們設(shè)計了甲基化特異性引物,通過Hep G2和Hep3B細(xì)胞系甲基化特異性PCR(MSP)了解這一區(qū)域的DNA甲基化狀態(tài)。然后我們又在24對肝癌及癌旁組織中進(jìn)行MSP檢測,進(jìn)一步了解組織中這一區(qū)域的DAN甲基化狀態(tài)。然后,我們又對這一Cp G島進(jìn)行了亞硫酸鹽測序PCR(BSP)檢測其甲基化狀態(tài)。為了進(jìn)一步明確mi R-22啟動子區(qū)域的核心序列,我們將一系列mi R-22啟動子區(qū)的5’端截短序列克隆至p GL3Basic載體的多克隆位點(diǎn),將其與p RL-TK共轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系后,雙熒光素酶報告基因分別檢測其熒光強(qiáng)度。確定啟動子區(qū)的核心序列后,我們針對這一區(qū)域設(shè)計了特異性的Ch IP引物,然后分別使用EZH2、H3K27me3、Ig G抗體在EZH2敲低、過表達(dá)的肝癌細(xì)胞系中,進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測在這一核心區(qū)域相應(yīng)蛋白的富集情況。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Ch IP實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,我們檢索了ENCODE(Encyclopedia of DNA elements)在線數(shù)據(jù)庫,來研究這一區(qū)域相關(guān)蛋白的富集情況。結(jié)果我們在mi R-22轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近發(fā)現(xiàn)了長約858bp的甲基化島,細(xì)胞和組織的甲基化特異性PCR結(jié)果均顯示mi R-22啟動子區(qū)域呈低DNA甲基化狀態(tài)。亞硫酸鹽測序PCR同樣證明這一區(qū)域呈低甲基化狀態(tài)。雙熒光素酶報告基因檢測啟動子區(qū)域5’端的截短載體活性發(fā)現(xiàn),mi R-22轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-337~-65區(qū)域?yàn)閱幼雍诵男蛄�。在EZH2敲低、過表達(dá)、及對照細(xì)胞中分別進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀檢測發(fā)現(xiàn)EZH2、H3K27me3在這一核心區(qū)域明顯富集,EZH2敲低可顯著降低其在這一區(qū)域的富集狀態(tài)。ENCODE數(shù)據(jù)庫中EZH2抗體在Hep G2細(xì)胞中的Ch IP-seq數(shù)據(jù)與我們的結(jié)果相似。結(jié)論EZH2通過mi R-22啟動子上游核心序列的組蛋白H3賴氨酸K27的三甲基化抑制mi R-22的轉(zhuǎn)錄,而非通過DNA的超甲基化。第四部分mi R-22和galectin-9對肝癌惡性生物學(xué)行為的影響目的在體內(nèi)和體外水平研究mi R-22和galectin-9對肝癌細(xì)胞系Hep G2惡性生物學(xué)行為的影響方法使用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染mi R-22前體及空白載體的Hep G2細(xì)胞系,篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)細(xì)胞株后,將其分別共轉(zhuǎn)染galectin-9過表達(dá)載體。Western blot檢測各穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中g(shù)alectin-9的表達(dá)水平。CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測各細(xì)胞系的增殖能力,流式細(xì)胞凋亡檢測分析凋亡細(xì)胞比例,并使用western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、活化的caspase-3、BAX以及Bcl-2的表達(dá)。為了評估各細(xì)胞系的惡性行為,平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測其定植能力,并使用transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)分別評估Hep G2細(xì)胞系的轉(zhuǎn)移和侵襲的能力。裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)評估各細(xì)胞系體外成瘤的能力,免疫組化分析各組瘤體中Ki-67及CD31表達(dá)情況。裸鼠腫瘤肺轉(zhuǎn)移模型來檢測各Hep G2細(xì)胞系遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力。結(jié)果穩(wěn)定轉(zhuǎn)染mi R-22前體的Hep G2細(xì)胞中g(shù)alectin-9表達(dá)下調(diào),CCK-8細(xì)胞增殖試驗(yàn)提示mi R-22過表達(dá)能抑制腫瘤細(xì)胞增殖;流式細(xì)胞凋亡檢測記過顯示過表達(dá)mi R-22前體細(xì)胞中凋亡比例明顯增加;克隆形成實(shí)驗(yàn)證明過表達(dá)mi R-22細(xì)胞克隆形成能力明顯下降;transwell轉(zhuǎn)移和侵襲實(shí)驗(yàn)證明mi R-22的表達(dá)明顯抑制Hep G2細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力。共轉(zhuǎn)染galectin-9后,有意思的是galectin-9和mi R-22一起協(xié)同抑制細(xì)胞增殖,促進(jìn)凋亡,抑制克隆形成能力和轉(zhuǎn)移及侵襲能力。動物實(shí)驗(yàn)中,成瘤實(shí)驗(yàn)和腫瘤肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)均證實(shí)mi R-22和galectin-9可協(xié)同抑制移植瘤的形成并抑制其轉(zhuǎn)移。結(jié)論mi R-22與galectin-9協(xié)同抑制肝癌細(xì)胞增殖,促進(jìn)其凋亡,抑制其轉(zhuǎn)移和侵襲能力。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.7
【圖文】：

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文間差異使用 Student t 檢驗(yàn)進(jìn)行分析。結(jié) 果1. IFN-γ 刺激對肝癌細(xì)胞系 galectin-9 表達(dá)的作用1.1. IFN-γ 濃度梯度對 galectin-9 表達(dá)影響分別使用 PBS 以及濃度為 0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml 的 IFN-γ 刺激人肝癌細(xì)胞系 HepG2 及 Hep3B。24 小時后檢測 galectin-9 在 RNA 和蛋白水平表達(dá)的改變，IRF1（胰島素反應(yīng)因子 1）作為陽性對照。我們發(fā)現(xiàn)隨著 IFN-γ 濃度的增高，galectin-9 表達(dá)上調(diào)，呈明顯濃度依賴性（圖 1- 1）。

IRF1（胰島素反應(yīng)因子 1）作為陽性對照。我們發(fā)現(xiàn)隨著 IFN-γ 濃度的增高，galectin-9 表達(dá)上調(diào)，呈明顯濃度依賴性（圖 1- 1）。.2. IFN-γ 刺激的時間對 galectin-9 表達(dá)的影響使用終濃度為 10ng/ml 的 IFN-γ 刺激肝癌細(xì)胞，在不同時間點(diǎn)檢測 galectin-9 及IRF1 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn) galectin-9 表達(dá)上調(diào)呈時間依賴性（圖 1- 2）。圖 1- 1 IFN-γ 刺激下，肝癌細(xì)胞中 galectin-9 及 IRF1 表達(dá)上調(diào)，且呈濃度依賴性。

中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 在 IFN-γ 刺激下 EZH2 表達(dá)上調(diào)表明 IFN-γ 刺激能調(diào)節(jié)相關(guān)基因啟動子區(qū)域的組蛋白 H3 第化水平，改變?nèi)旧|(zhì)構(gòu)象，從而調(diào)控基因的表達(dá)。EZH2 是的關(guān)鍵酶，因此我們研究在 IFN-γ 不同濃度及刺激時間作用。結(jié)果表明，EZH2 同樣呈現(xiàn)出濃度及時間依賴性（圖 1- 3

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 María L Bacigalupo;Malena Manzi;Gabriel A Rabinovich;María F Troncoso;;Hierarchical and selective roles of galectins in hepatocarcinogenesis, liver fibrosis and inflammation of hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2013年47期

本文編號：2803437