【摘要】：信號素(semaphorin, SEMA)是一類膜結(jié)合蛋白質(zhì)家族,最初被認(rèn)為是神經(jīng)系統(tǒng)中的一種軸突導(dǎo)向因子,后來人們發(fā)現(xiàn)該家族成員在腫瘤組織中的表達(dá)出現(xiàn)異常,并影響腫瘤進(jìn)程。信號素4A(semaphorin 4 A, SEMA4A)是該家族成員之一,主要以膜結(jié)合蛋白的形式存在,但其胞外段可經(jīng)蛋白水解斷裂釋放到細(xì)胞外的微環(huán)境中。SEMA4A多表達(dá)于免疫細(xì)胞并參與炎性反應(yīng),但其在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)及功能尚不清楚。腫瘤微環(huán)境中腫瘤細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞間的相互作用是促進(jìn)前列腺癌(prostate cancer, PCa)轉(zhuǎn)移的重要因素,釋放到微環(huán)境中的SEMA4A發(fā)揮怎樣的作用也尚需明確。通過本研究發(fā)現(xiàn)SEMA4A在前列腺癌中的表達(dá)明顯升高,且與Gleason評分及腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)；體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明SEMA4A可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,并且該作用是通過調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換發(fā)生的。重要的是,我們發(fā)現(xiàn)SEMA4A可上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞中IL-10的表達(dá)和分泌,而IL-10又進(jìn)一步促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞中SEMA4A的表達(dá),兩者在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移方面存在協(xié)同性。即在腫瘤微環(huán)境中,SEMA4A和IL-10很有可能形成正反饋調(diào)控途徑,促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。另外,本研究還發(fā)現(xiàn)SEMA4A和IL-10共同受到STAT3表達(dá)調(diào)控,并且前二者在發(fā)揮作用時(shí)也依賴于STAT3o綜上,通過本研究較為系統(tǒng)探討了SEMA4A在前列腺中的表達(dá)和功能,發(fā)現(xiàn)其作為一種癌基因,可促進(jìn)前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生；另外,該分子可能介導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞的相互作用,協(xié)同IL-10促進(jìn)癌變進(jìn)展。研究目的：1、分析SEMA4A在我國前列腺癌患者組織中的表達(dá)特點(diǎn)2、研究SEMA4A對前列腺癌細(xì)胞的作用及其機(jī)制3、探討SEMA4A在前列腺癌腫瘤微環(huán)境中的作用及其機(jī)制研究方法：1、分析SEMA4A在我國前列腺癌患者組織中的表達(dá)特點(diǎn)1.1免疫組織化學(xué)法檢測SEMA4A在PCa及BPH組織中的表達(dá)情況,并結(jié)合其他病理指標(biāo)分析其異常表達(dá)的臨床意義。1.2利用GEO數(shù)據(jù)庫對SEMA4A在前列腺癌中的表達(dá)情況進(jìn)行分析。1.3運(yùn)用RT-qPCR法及Western Blot法檢測SEMA4A在前列腺癌各細(xì)胞株中的表達(dá)情況。2、研究SEMA4A對前列腺癌細(xì)胞的作用及其機(jī)制2.1 MTS法檢測加入SEMA4A小干擾RNA (siRNA)或重組人SEMA4A蛋白(rhSEMA4A)后,細(xì)胞的增殖能力變化。2.2 Transwell小室法檢測加入SEMA4A小干擾RNA(siRNA)或重組人SEMA4A蛋白(rhSEMA4A)后,細(xì)胞遷移能力的變化。2.3分別用RT-qPCR法及Western Blot法檢測加入SEMA4A小干擾RNA(siRNA)或重組人SEMA4A蛋白(rhSEMA4A)后,細(xì)胞內(nèi)EMT指標(biāo)表達(dá)在mRNA水平和蛋白水平的變化情況,并找出其作用受體。3、探討SEMA4A在前列腺癌腫瘤微環(huán)境中的作用及其機(jī)制3.1采用細(xì)胞因子蛋白芯片及ELISA檢測SEMA4A對間質(zhì)細(xì)胞WPMY-1的細(xì)胞因子分泌情況的影響,并篩選出其作用于間質(zhì)細(xì)胞時(shí)所依賴的受體。3.2 Transwell小室法檢測加入重組IL-10后,前列腺癌細(xì)胞遷移能力的變化。3.3間接共培養(yǎng)與Transwell小室法相結(jié)合,檢測腫瘤細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)對腫瘤細(xì)胞遷移能力的影響。并用siRNA方法沉默SEMA4A的表達(dá)或用IL-10中和抗體阻斷IL-10的效應(yīng),以驗(yàn)證SEMA4A與IL-10在共培養(yǎng)體系中發(fā)揮的作用。3.4向裸鼠體內(nèi)單獨(dú)注射腫瘤細(xì)胞或?qū)⒛[瘤細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞混合后注射,比較雙肺轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量,以驗(yàn)證腫瘤微環(huán)境中腫瘤細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞相互作用對腫瘤轉(zhuǎn)移的影響以及SEMA4A在這其中可能發(fā)揮的作用。3.5 Western Blot驗(yàn)證STAT3對SEMA4A表達(dá)調(diào)控的作用,并通過染色質(zhì)免疫共沉淀法(ChIP)驗(yàn)證STAT3與SEMA4A啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合情況。3.6在共培養(yǎng)體系或體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中加入STAT3的選擇性抑制劑Stattic以證明SEMA4A在腫瘤微環(huán)境中主要通過STAT3途徑發(fā)揮作用。結(jié)果：1、 SEMA4A在我國前列腺癌患者組織中的表達(dá)高于正�；蛄夹栽錾那傲邢俳M織,且主要表達(dá)于癌細(xì)胞的胞膜上,其在癌細(xì)胞的胞漿中及間質(zhì)細(xì)胞中均沒有表達(dá)。結(jié)合臨床病理指標(biāo)分析,SEMA4A高表達(dá)與前列腺癌Gleason評分及轉(zhuǎn)移相關(guān)。2、 SEMA4A可在體外促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的遷移能力而對該細(xì)胞增殖能力的影響不明顯。此外,本研究發(fā)現(xiàn),SEMA4A可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT進(jìn)程的發(fā)展,并可能是其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移的主要途徑。3、SEMA4A可通過間質(zhì)細(xì)胞上的NRP-1受體發(fā)揮作用,促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞分泌IL-10,而IL-10也可作用于腫瘤細(xì)胞并上調(diào)SEMA4A的表達(dá)。兩者可協(xié)同發(fā)揮作用,促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞發(fā)生遷移。此外,IL-10可激活前列腺癌細(xì)胞上的STAT3信號通路,經(jīng)活化的P-STAT3可入核并直接結(jié)合于SEMA4A的啟動(dòng)子區(qū),從而調(diào)控SEMA4A的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。SEMA4A/IL-10/STAT3在前列腺癌腫瘤微環(huán)境中形成正反饋調(diào)節(jié)途徑,并推動(dòng)前列腺癌的EMT進(jìn)程,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。結(jié)論：SEMA4A可促進(jìn)前列腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移,并是腫瘤微環(huán)境中的關(guān)鍵調(diào)控因子。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.25

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1 馬建宏;曹開源;徐霖;鐘慧玲;張素粉;羅虹嬌;庹玖玲;張?zhí)?劉建中;;前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的篩選[J];熱帶醫(yī)學(xué)雜志;2015年11期

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本文編號：2802760