【摘要】：目的:本課題旨在研究肺癌組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)對肺癌細(xì)胞系生物學(xué)特征的影響,并初步探究肺癌相關(guān)MSCs促進(jìn)肺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制。方法:無菌條件下收集新鮮切除的肺癌患者瘤組織分離肺癌相關(guān)MSCs,并進(jìn)行體外培養(yǎng)傳代及鑒定。慢病毒感染建立穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白(CopGFP)的人肺腺癌細(xì)胞株A549和H1299。體外,Brdu法檢測肺癌相關(guān)MSCs對A549和H1299增殖的影響;劃痕實(shí)驗(yàn)檢測肺癌相關(guān)MSCs對A549和H1299遷移能力的影響;Transwell法檢測肺癌相關(guān)MSCs對A549和H1299侵襲能力的影響。體內(nèi),檢測肺癌相關(guān)MSCs有無致瘤性;A549細(xì)胞按高、中、低三種細(xì)胞數(shù)進(jìn)行裸鼠皮下接種,利用小動物活體成像技術(shù)觀察肺癌相關(guān)MSCs對A549生長的影響;尾靜脈注射A549細(xì)胞,利用小動物活體成像技術(shù)觀察肺癌相關(guān)MSCs對A549轉(zhuǎn)移能力的影響。qPCR和Western blotting檢測A549與肺癌相關(guān)MSCs共培養(yǎng)后的A549細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相關(guān)指標(biāo)表達(dá)的變化;qPCR檢測A549與肺癌相關(guān)MSCs共培養(yǎng)后A549細(xì)胞干性指標(biāo)(CD133、CD44、NANOG、SOX2、OCT4)變化;ELISA法分別檢測A549和肺癌相關(guān)MSCs基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2的分泌水平,qPCR檢測A549與肺癌相關(guān)MSCs共培養(yǎng)后的MMP2變化,從而初步探究肺癌相關(guān)MSCs促進(jìn)肺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制。結(jié)果:成功從肺癌患者瘤組織中分離并培養(yǎng)肺癌相關(guān)MSCs,經(jīng)鑒定其具有多向分化潛能,且表面標(biāo)志表達(dá)符合國際認(rèn)定標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)慢病毒感染成功建立穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的人肺腺癌細(xì)胞株A549-CopGFP和H1299-CopGFP。體外,肺癌相關(guān)MSCs對肺癌細(xì)胞增殖無明顯影響,但可明顯提高肺癌細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力。體內(nèi),肺癌相關(guān)MSCs不但能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞的生長,提高肺癌細(xì)胞在體內(nèi)的成瘤率,還能促進(jìn)肺癌細(xì)胞在體內(nèi)轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),肺癌細(xì)胞與腫瘤相關(guān)MSCs共培養(yǎng)后,肺癌細(xì)胞EMT指標(biāo)(轉(zhuǎn)錄因子Snail和Slug)在RNA和蛋白水平上明顯增加,干性指標(biāo)(CD133、CD44、NANOG、SOX2、OCT4)在RNA水平上明顯增加。肺癌細(xì)胞表達(dá)MMP2較低,但肺癌相關(guān)MSCs高表達(dá)MMP2;腫瘤相關(guān)MSCs能夠促進(jìn)MMP2 RNA水平的表達(dá)。結(jié)論:本課題成功分離并鑒定了肺癌組織來源的肺癌相關(guān)MSCs,首次通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)明確肺癌相關(guān)MSCs能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,這一作用與肺癌相關(guān)MSCs促進(jìn)肺癌細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化、增強(qiáng)干性以及肺癌相關(guān)MSCs高分泌MMP2有關(guān)。本研究有力證明了肺癌相關(guān)MSCs與腫瘤細(xì)胞的相互作用,為深入研究間充質(zhì)干細(xì)胞與腫瘤及其微環(huán)境之間的相互聯(lián)系提供了理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R734.2
【圖文】：

固定成軟骨細(xì)胞球，進(jìn)行石蠟包于組化罐中進(jìn)行脫蠟和脫水，后，完成后將切片放于自來水沖洗分離所得細(xì)胞形成的成軟骨切片染色效果（染色部分是軟骨組織 的形態(tài)特點(diǎn)養(yǎng) 3 天時，于顯微鏡下進(jìn)行觀壁細(xì)胞，呈長梭形；約 14 天左化傳代，約 1 周左右細(xì)胞達(dá)到 ，傳代后細(xì)胞呈典型成纖維細(xì)胞行排列（圖 1）。

培養(yǎng) 3 天時，于顯微鏡下進(jìn)行觀察發(fā)貼壁細(xì)胞，呈長梭形；約 14 天左右，消化傳代，約 1 周左右細(xì)胞達(dá)到 80%代，傳代后細(xì)胞呈典型成纖維細(xì)胞狀平行排列（圖 1）。圖 1 肺癌相關(guān) MSCs 的細(xì)胞形態(tài)（10s 的生長曲線分離所得細(xì)胞的生長曲線呈 S 型，細(xì)4~48h 的潛伏期，細(xì)胞進(jìn)入快速生長期，細(xì)胞的增殖及生長趨勢放緩，進(jìn)入

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 一、肺癌相關(guān) MSCs 的分離、培養(yǎng)及鑒定1.2.3 肺癌相關(guān) MSCs 的表型特點(diǎn)流式檢測該分離所得細(xì)胞表面標(biāo)志物結(jié)果顯示，該細(xì)胞表達(dá) CD73（99.8%）、CD90（99.8%）、CD105（57.1%）和 CD166（98.0%），不表達(dá) CD14、CD19、CD34、CD45 和 HLA-DR（圖 3）。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 李梅;武毅;劉仁旺;郭麗麗;徐婷婷;陳軍;徐嵩;;間充質(zhì)干細(xì)胞對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的初步探討[J];中國肺癌雜志;2015年11期

本文編號：2799890