【摘要】：[目的]1、應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制惡性黑色素瘤A375和A875細(xì)胞中LTBP4基因的表達(dá),構(gòu)建LTBP4沉默的惡性黑色素瘤細(xì)胞;2、通過CCK-8、Transwell、流式細(xì)胞術(shù)分別檢測惡性黑色素細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及凋亡情況,探討LTBP4對惡性黑色素瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響及其分子機(jī)制。[方法]1、LTBP4沉默的惡性黑色素瘤細(xì)胞系建立將惡性黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375和A875均分為3組,即實驗轉(zhuǎn)染組(siR-LTBP4)、陰性對照組(siR-NC)、空白對照組(Control)。實驗轉(zhuǎn)染組用 LTBP4特異性shRNA表達(dá)載體plvx-shRNA2-LTBP4經(jīng)LipofectamineTM2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染上述兩種惡性黑色素瘤細(xì)胞系;陰性對照組用plvx-shRNA2-NC經(jīng)LipofectamineTM2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染兩種細(xì)胞系;空白對照組的兩組細(xì)胞系均未做任何處理。熒光顯微鏡下觀察兩株細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。運用熒光定量PCR和Western blot分別檢測LTBP4基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平,了解沉默效率。2、LTBP4沉默對惡性黑色素瘤細(xì)胞影響的檢測采用第一部分構(gòu)建的LTBP4沉默的惡性黑色素瘤細(xì)胞,通過CCK-8檢測細(xì)胞的增殖情況;Transwell遷移實驗檢測細(xì)胞的遷移情況;Transwell侵襲實驗檢測細(xì)胞的侵襲情況;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況;探討LTBP4對惡性黑色素瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。3、LTBP4對TGF-β/BMP信號通路的影響沉默LTBP4后檢測惡性黑色素瘤A375中TGF-β活性的變化,并通過Western blot檢測了 LTBP4對不同形式TGF-β的影響。[結(jié)果]1、成功構(gòu)建了LTBP4沉默的惡性黑色素瘤細(xì)胞系構(gòu)建了LTBP4沉默質(zhì)粒,并成功轉(zhuǎn)染至兩株惡性黑色素瘤細(xì)胞系中。熒光顯微鏡下,觀測到轉(zhuǎn)染效率達(dá)到80%以上。熒光定量PCR結(jié)果顯示:進(jìn)行擴(kuò)增時,溶解曲線出現(xiàn)特異性峰,無非特異性擴(kuò)增,獲得的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。各樣本采用2-△△Ct的相對表達(dá)量進(jìn)行初步統(tǒng)計。熒光定量PCR結(jié)果顯示,LTBP4的siRNA能夠有效抑制LTBP4的mRNA表達(dá)水平,與control組或siR-NC組相比,差異具有顯著性(P0.05)。而siR-NC組的LTBP4的mRNA表達(dá)水平同control組相比,無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。Western blot檢測結(jié)果顯示:siR-LTBP4能夠有效抑制LTBP4在惡性黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375和A875中的表達(dá)水平,與control組和siR-NC組相比,差異具有顯著性(P0.05)。Control組和siR-NC組相比,LTBP4的表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。2、LTBP4沉默后對惡性黑色素瘤細(xì)胞的影響CCK-8實驗發(fā)現(xiàn)在24h和48h siR-LTBP4組的A875細(xì)胞和A375細(xì)胞均較siR-NC組和control組的增殖能力明顯減弱,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);siR-NC組與control組在24h和48h相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05) ; A375和A875分別在不同時間,相同分組比較差異也具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。Transwell遷移實驗發(fā)現(xiàn)siR-LTBP4組遷移到Transwell小室下室面的A875細(xì)胞和A375細(xì)胞均較siR-NC組和control組明顯減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);siR-NC組與control組遷移細(xì)胞數(shù)相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。Transwell侵襲實驗發(fā)現(xiàn)siR-LTBP4組侵襲到Transwell小室下室面的A875細(xì)胞和A375細(xì)胞均較siR-NC組和control組明顯減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05 );siR-NC組與control組侵襲細(xì)胞數(shù)相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,siR-LTBP4轉(zhuǎn)染后能夠明顯升高惡性黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375和A875的凋亡率,同control組和siR-NC組相比,差異具有顯著性(P0.05 )。Control組和siR-NC組相比較,在兩個細(xì)胞中均無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。3、LTBP4沉默后可調(diào)控TGF-β/BMP信號通路LTBP4沉默后,細(xì)胞培養(yǎng)基中激活形式的TGF-β含量明顯降低,而總TGF-β含量明顯升高。Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGF-β1的表達(dá)水平無明顯變化,而TGF-β2和TGF-β3的蛋白表達(dá)水平顯著增加。[結(jié)論]1、通過RNAi技術(shù)可有效抑制惡性黑色素瘤細(xì)胞A375和A875中LTBP4的表達(dá),并使siR-LTBP4組的遷移、侵襲和增殖能力減弱,凋亡增強(qiáng),LTBP4基因可能與惡性黑色素瘤的遷移、侵襲、增殖和凋亡有關(guān)。2、LTBP4沉默后惡性黑色素瘤細(xì)胞A375中TGF-β含量有明顯變化,LTBP4可能參與調(diào)控TGF- β/BMP信號通路。3、LTBP4基因可能成為惡性黑色素瘤新的治療靶點,為惡性黑色素瘤靶向治療藥物的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R739.5
【圖文】：

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本文編號：2799732