【摘要】：背景RNF139(Ring Finger Protein 139),是一個含有Ring-H2的多次跨膜蛋白。該蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),擁有泛素連接酶的活性。最近一項非小細(xì)胞肺癌對白蛋白紫杉醇的耐藥組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)RNF139在白蛋白紫杉醇耐藥的腫瘤細(xì)胞系中的蛋白水平表達(dá)顯著升高。白蛋白紫杉醇作為目前胰腺癌客觀緩解率最高的化療藥物,其效果不好一直是困擾臨床的主要問題,因此我們設(shè)想RNF139在胰腺癌中是否會通過某些抗凋亡的相關(guān)分子機制導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對白蛋白紫杉醇產(chǎn)生敏感性,且目前在胰腺癌中尚未有關(guān)于RNF139的任何報道。通過預(yù)實驗結(jié)果以及在線數(shù)據(jù)庫分析,我們發(fā)現(xiàn)與胰腺組織相比,胰腺導(dǎo)管腺癌患者的手術(shù)標(biāo)本中RNF139的mRNA水平以及蛋白水平表達(dá)量明顯升高;與正常胰腺導(dǎo)管細(xì)胞系相比,胰腺癌細(xì)胞系中的RNF139的表達(dá)也明顯上調(diào);RNF139與細(xì)胞凋亡相關(guān)基因呈明顯正相關(guān)。乏氧環(huán)境下,胰腺癌細(xì)胞系中RNF139的表達(dá)量明顯上調(diào)。從而,我們進一步設(shè)計實驗探索在胰腺癌中RNF139表達(dá)升高與患者的生存、預(yù)后以及各個臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系,以及RNF139在胰腺癌抗凋亡中的作用和調(diào)控機制,目的是從臨床水平、分子生物學(xué)水平、細(xì)胞水平及動物實驗水平等不同研究層次深入探索乏氧環(huán)境下胰腺導(dǎo)管腺癌中RNF139參與胰腺癌抗凋亡以及RNF139可能對乏氧的反饋調(diào)節(jié)的臨床意義與分子機制,為尋求新的胰腺癌治療靶點提供理論依據(jù)和應(yīng)用基礎(chǔ)。方法1.進一步收集胰腺導(dǎo)管腺癌患者的組織石蠟標(biāo)本擴大研究樣本量,進行連續(xù)切片,對HIF-1α及RNF139進行共定位免疫組化染色,之后從組織蛋白表達(dá)水平來統(tǒng)計兩者之間表達(dá)量的相關(guān)性,同時結(jié)合患者的臨床病理學(xué)參數(shù)綜合分析RNF139表達(dá)水平與各個臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。2.應(yīng)用免疫印跡試驗(Western Blot,WB)、實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction,RT-qPCR)等技術(shù)檢測胰腺癌細(xì)胞系以及正常胰腺導(dǎo)管細(xì)胞系中RNF139及HIF-1α的mRNA以及蛋白水平的表達(dá)量并分析其相關(guān)性;采用免疫熒光技術(shù)檢測RNF139在胰腺癌細(xì)胞中的細(xì)胞定位。3.應(yīng)用分子克隆方法構(gòu)建RNF139、HIF-1α過表達(dá)質(zhì)粒以及RNF139、HIF-1α的shRNA降表達(dá)質(zhì)粒,建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系;用WB、RT-qPCR及檢測所構(gòu)建穩(wěn)系RNF139及HIF-1α表達(dá)水平。4.應(yīng)用TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)、流式細(xì)胞術(shù)等實驗方法檢測上述構(gòu)建的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的凋亡比例。應(yīng)用瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù),在過表達(dá)HIF-1α的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系瞬時轉(zhuǎn)染RNF139的siRNA并檢測其凋亡比例的變化;在降表達(dá)HIF-1α的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中瞬時轉(zhuǎn)染過表達(dá)RNF139的質(zhì)粒,并比較其凋亡比例的變化。5.應(yīng)用WB、RT-qPCR等檢測RNF139穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中VHL及HIF-1α的表達(dá)水平。在降表達(dá)RNF139的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中瞬時轉(zhuǎn)染VHL的過表達(dá)質(zhì)粒、在過表達(dá)RNF139的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中瞬時轉(zhuǎn)染降表達(dá)VHL的siRNA并比較其凋亡比例的變化。6.利用NOD-SCID小鼠構(gòu)建胰腺癌皮下成瘤模型,記錄皮下腫瘤生長曲線。3周后取瘤體,體內(nèi)驗證RNF139對胰腺癌抗凋亡的影響。結(jié)果1.我們對搜集的115例手術(shù)標(biāo)本進行了臨床相關(guān)性分析,并從其中隨機抽取8例成對標(biāo)本進行RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn),與配對的胰腺正常組織相比RNF139在胰腺癌組織中呈高表達(dá)水平,且RNF139的高表達(dá)與胰腺癌患者的總生存預(yù)后呈負(fù)相關(guān),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);分析TCGA(The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)作為驗證隊列,結(jié)果一致。2.應(yīng)用分子克隆技術(shù),分別構(gòu)建過表達(dá)RNF139穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系兩株(SW1990-pLV-RNF139、MIA PaCa2-pLV-RNF139)和降表達(dá)RNF139穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系兩株(SW1990-pLV-ShRNF139、MIA PaCa-2-pLV-ShRNF139),經(jīng)白蛋白紫杉醇處理后采用流式細(xì)胞術(shù)以及TUNEL檢測對照組以及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)RNF139組凋亡比例顯著降低,降表達(dá)RNF139組凋亡比例顯著升高。WB檢測凋亡相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn),Caspase-12、Caspase-3等顯著改變。用各對照組及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系在裸鼠皮下構(gòu)建皮下成瘤模型,發(fā)現(xiàn)與對照組相比降表達(dá)RNF139組腫瘤體積顯著減小;進一步研究證實,降表達(dá)RNF139組凋亡比例顯著升高。3.通過數(shù)據(jù)庫分析以及文獻提示,RNF139定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),該家族成員可影響細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。采用WB技術(shù)檢測瞬轉(zhuǎn)過表達(dá)及降表達(dá)RNF139胰腺癌細(xì)胞系發(fā)現(xiàn),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的蛋白eIF2α、CHOP等改變明顯,即RNF139可通過影響胰腺癌細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來影響胰腺癌細(xì)胞的凋亡。4.胰腺癌細(xì)胞經(jīng)乏氧處理后,RNF139在mRNA水平及蛋白水平顯著上調(diào)。在組織水平、細(xì)胞水平,HIF-1α與RNF139的表達(dá)具有一致性。數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)RNF139的啟動子區(qū)有HIF-1α的特異性結(jié)合位點。染色質(zhì)免疫共沉淀實驗以及雙熒光素酶報告系統(tǒng)發(fā)現(xiàn),HIF-1α可與RNF139啟動子區(qū)的低氧反應(yīng)元件結(jié)合并啟始其轉(zhuǎn)錄。結(jié)果表明,RNF139是HIF-1的直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控靶點。5.WB檢測發(fā)現(xiàn),過表達(dá)RNF139的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中,HIF-1α顯著上調(diào),VHL表達(dá)顯著下調(diào);RNF139降表達(dá)細(xì)胞系中,HIF-1α顯著下調(diào),VHL表達(dá)顯著上調(diào)。在降表達(dá)RNF139的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中瞬時轉(zhuǎn)染VHL的siRNA,并用WB檢測發(fā)現(xiàn)RNF139沒有顯著改變,HIF-1α表達(dá)量顯著上調(diào)。以上結(jié)果表明,RNF139可以通過VHL途徑影響HIF-1α的降解。6.RNF139是HIF-1在胰腺癌中發(fā)揮其抗凋亡作用的重要途徑之一。通過檢測過表達(dá)HIF-1α的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系及過表達(dá)HIF-1α后瞬時轉(zhuǎn)染降表達(dá)RNF139的細(xì)胞系的凋亡發(fā)現(xiàn),相較于前者,后者的凋亡比例明顯增加。結(jié)論1.RNF139在胰腺癌中表達(dá)升高,并且RNF139的高表達(dá)具有重要的臨床意義2.RNF139可通過影響胰腺癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來參與胰腺癌細(xì)胞的抗凋亡3.HIF-1α可通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控RNF139的表達(dá)從而影響胰腺癌的凋亡;HIF-1α的表達(dá)與白蛋白紫杉醇的治療效果相關(guān)4.RNF139可通過減少VHL的表達(dá)來上調(diào)HIF-1α的表達(dá)從而形成正反饋環(huán)路
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.9
【圖文】：

總生存的 Kaplan-Meier 曲線分析；用卡方檢驗分析 RNF139 蛋白表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性；Cox 比例風(fēng)險回歸模型用于多變量分析評估影響胰腺癌患者預(yù)后的獨立危險因素。P值小于 0.05 時被認(rèn)為是有統(tǒng)計學(xué)意義的。1.2 結(jié)果1.2.1 115 例胰腺腺癌患者基本信息在 123 例 PDAC 中，排除了 8 例非腫瘤致死病例，剩余病例 115 例。其中男性 65人、女性 50 人。年齡<65 歲 80人，年齡≥65 歲 35人。123例病例中，22 例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；外周血管侵犯 38 例；高分化 9 例，中分化 64 例，低分化34 例；I-II 期 82 例、III 期 23 例。43 例腫瘤的最大直徑≤2 cm。1.2.2RNF139 在胰腺癌組織標(biāo)本中的表達(dá)RNF139 位于細(xì)胞漿里內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。分析組化染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RNF139 在胰腺導(dǎo)管腺癌中的表達(dá)水平較正常組織顯著升高（圖 1.1）。在新鮮的癌和癌旁配對組織的 mRNA 水平表達(dá)量也證實了 RNF139 在胰腺癌中的高表達(dá)（圖 1.2）

9 在胰腺癌及癌旁配對組織中 mRNA水平的表水平與臨床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系醫(yī)師的評分，我們將篩選出的 115例 PDAC低表達(dá)組。各病理學(xué)參數(shù)也分為兩組，再將 數(shù)進行統(tǒng)計分析，各臨床數(shù)據(jù)與 RNF139 的分析，可發(fā)現(xiàn)腫瘤大小、pT 分期以及一二站淋平相關(guān)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）管腺癌中 RNF139 表達(dá)水平與臨床病理學(xué)參 例數(shù)RNF139 表達(dá)水平低 高 82 62 3023 10 13性結(jié)陽性）

學(xué)碩士學(xué)位論文 一、RNF139 在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中高表達(dá)著縮短。我們使用同樣的方法在 TCGA數(shù)據(jù)庫中進行了驗即 RNF139 低表達(dá)組患者的生存期顯著優(yōu)于 RNF139 高表

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本文編號：2797406