【摘要】：目的：考察介孔二氧化硅納米微粒(Mesoporous silica nanoparticle，MSNP）共轉(zhuǎn)運體系逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥、殺傷腫瘤細(xì)胞的效果，證實阿霉素（Doxorubicin，DOX）與MDR1-siRNA共同應(yīng)用具有協(xié)同抗腫瘤作用，并初步探索自噬在殺傷腫瘤細(xì)胞過程中的作用。 方法：首先采用溶膠-凝膠法制備介孔二氧化硅納米粒子，通過表面修飾陽離子聚合物聚乙烯亞胺（Polyethylenimine，PEI）使其帶有正電荷，能夠與帶負(fù)電的MDR1-siRNA相結(jié)合，同時將抗腫瘤藥物DOX吸附于介孔內(nèi)部，形成載藥、載基因的共轉(zhuǎn)運體系。采用透射電鏡觀察粒子形貌、動態(tài)光散射測得粒子電勢，利用紫外可見分光光度法測定載藥量和藥物釋放曲線；通過MTT法測定DOX對口腔鱗癌細(xì)胞株KB及耐藥株KBV的半抑制濃度IC50；使用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀測定轉(zhuǎn)染效率。體外通過Real-Time PCR技術(shù)檢測MDR1基因的表達(dá)水平；AnnexinV-FITC/7-AAD雙染法經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況；Western Blot檢測凋亡及自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。體內(nèi)建立裸鼠荷瘤模型，進一步驗證介孔二氧化硅納米微粒共轉(zhuǎn)運體系治療耐藥口腔鱗狀細(xì)胞癌的效果。 結(jié)果：透射電鏡下觀察所合成的粒子尺寸為80-100nm，表面介孔直徑約3-5nm，分散性較好，尺寸均一；紫外法測得粒子的載藥量為18.5%，藥物的釋放速率初期較快，10h釋放達(dá)30%，隨時間延長速率減慢，120h累積釋放達(dá)70%以上；紫外法測得IC50(KB-DOX)=182.9ng/ml、 IC50(KBV-DOX)=9233.5ng/ml，計算KBV的耐藥倍數(shù)為50.483871倍；熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀測得pEGFP和siRNAFAM轉(zhuǎn)染效率分別為6.73%、32.44%；Real-Time PCR結(jié)果提示：與空白對照組相比，MDR1-siRNA能夠顯著下調(diào)MDR1mRNA水平；AnnexinV-FITC/7-AAD雙染法經(jīng)流式細(xì)胞儀測得單純載藥、單純載基因組細(xì)胞凋亡率分別為12.74%、10.08%，雙載組細(xì)胞凋亡率為25.68%；體內(nèi)實驗結(jié)果顯示單純載藥組抑瘤率為58.67%，雙載組抑瘤率達(dá)81.64%；Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)，雙載組自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3水平明顯上調(diào)，而P62蛋白表達(dá)下降，提示細(xì)胞自噬的發(fā)生。 結(jié)論：介孔二氧化硅納米微粒共轉(zhuǎn)運體系能夠有效逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥、殺傷腫瘤細(xì)胞；與單純載藥、載基因組相比，同時應(yīng)用DOX與MDR1-siRNA具有協(xié)同抗腫瘤作用；并且在共轉(zhuǎn)運體系治療耐藥口腔癌的過程中，自噬可能起到重要的作用。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R739.8
【圖文】：

第 2 章 MSNP-PEI/基因復(fù)合物的制備與表征板的每孔中接30×104個KBV細(xì)胞，培養(yǎng)24h。制備w/w分別為、20：1的MSNP-PEI/pEGFP復(fù)合物，EGFP質(zhì)粒為2.5μg。轉(zhuǎn)染成無血清培養(yǎng)基，加入材料與質(zhì)粒的復(fù)合物，4h后換完全培1的PEI/pEGFP作為陽性對照組。48h后利用熒光顯微鏡觀察并通過流式細(xì)胞儀測定轉(zhuǎn)染效率。擴增鑒定后的質(zhì)粒經(jīng) Nanodrop 2000 測得 OD260nm：OD280nm=1.8～A 純度較高，無蛋白質(zhì)和 RNA 污染，pEGFP 濃度為 447.2ng/90.1ng/μl。質(zhì)粒經(jīng) EcoR I、Hind III 酶切鑒定結(jié)果如圖 2.1 所

圖 2.1 質(zhì)粒 pGFP-V-RS shRNA 圖譜及酶切鑒定結(jié)果2.2.2 透射電鏡利用PEI和MSNP之間靜電作用得到MSNP-PEI納米復(fù)合物。圖2.2A、B分別為合成的MSNP、MSNP-PEI透射電鏡圖片，可以觀察到MSNP、MSNP-PEI粒子形態(tài)規(guī)則，呈球形，粒徑分布在80-100nm之間，粒子表面有直徑為3-5nm的介孔。圖2.2 透射電鏡(TEM)圖片：(A) MSNP；(B) MSNP-PEI

復(fù)合物的平均粒徑為170.5±3.8nm，均較干燥后的勢為-24.3±2.7mV，與PEI復(fù)合后MSNP-PEI的電勢基因相結(jié)合。表2.2 粒徑和電勢Average particle size (nm) Ze150.4±6.9 12.9±0.7 170.5±3.8 阻滯實驗SNP-PEI 與質(zhì)粒的結(jié)合情況，進行 DNA 凝膠阻滯MSNP-PEI 與質(zhì)粒的 w/w 達(dá)到 10：1 時不再有 DN到 10：1 時，MSNP-PEI 能夠與質(zhì)粒 DNA 完全結(jié)

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2797282