【摘要】：熱休克蛋白70(Heat shock 70,HSP70)與乳腺腫瘤形成、發(fā)展、治療、預后和腫瘤治療中形成的藥物抵抗有關,從而成為抗腫瘤治療的新靶點。本論文通過熱休克(HS),即高熱(43℃)作用來誘導乳腺腫瘤細胞內HSP70表達增強,通過HSP70抑制劑VER-155008來抑制乳腺腫瘤細胞內HSP70的功能,采用MTT法研究HSP70功能對細胞增殖的影響。采用激光掃描共聚焦顯微成像技術和雙光子熒光顯微成像技術研究HSP70功能對乳腺腫瘤細胞中反映細胞代謝狀態(tài)的線粒體膜電位、NADH和FAD熒光強度以及氧化還原比率(RR)的影響。首先,使用BCA蛋白質定量試劑盒和人HSP70的ELISA檢測試劑盒檢測MCF-7和MDB-MA-23 1乳腺腫瘤細胞在HS作用前和HS作用后細胞中的HSP70含量的變化。利用MTT法測量了乳腺細胞MCF-7、MDA-MB-231和MCF-10A在單獨HS作用(43℃)、單獨HSP70抑制劑VER-155008作用以及HS和VER-155008聯(lián)合作用下乳腺細胞的增殖情況。結果表明三種乳腺細胞的高熱耐受能力存在明顯差異,從高到低依次為MCF-10A、MCF-7和MDA-MB-231。HS對細胞促增殖效應和增殖抑制效應與細胞種類和HS作用時長(1h、2h和3h)有關。HSP70功能抑制導致三種乳腺細胞的增殖均受到抑制,且其抑制效果呈現(xiàn)劑量相關性和作用時間依賴性;細胞在聯(lián)合作用下的增殖情況是單獨HS作用效果及單獨VER-155008作用效果的綜合。其次,應用激光掃描共聚焦顯微成像技術和線粒體膜電位熒光探針JC-1可視化和量化了乳腺腫瘤細胞MCF-7和MDA-MB-231在單獨HS作用(1h)、單獨VER-155008作用和兩者聯(lián)合作用開始后的24h、48h和72h下的線粒體形態(tài)結構、線粒體膜電位、含量及細胞尺寸的變化情況。結果表明,在三個測量時間下,對照組細胞和單獨HS作用下的細胞線粒體網(wǎng)絡完整,形態(tài)舒展,覆蓋了細胞內的大部分區(qū)域。線粒體的膜電位、含量和細胞尺寸與對照組細胞相比沒有統(tǒng)計差異;單獨VER-155008作用和聯(lián)合作用導致線粒體網(wǎng)絡破壞,線粒體膜電位、含量和細胞尺寸減小,出現(xiàn)了與細胞早期凋亡相似的現(xiàn)象,但聯(lián)合作用下的線粒體膜電位、含量和細胞尺寸減小的幅度小于單獨VER-155008作用減小的幅度。這預示著HSP70抑制誘導乳腺腫瘤細胞凋亡,但HS作用減輕了其促凋亡效果。最后,細胞內的自體熒光NADH和FAD是細胞氧化還原呼吸鏈上重要的輔酶,可作為靈敏的內源性含氧指標來反映機體的代謝狀態(tài)和細胞活力。采用構建的活細胞代謝光學測量系統(tǒng)監(jiān)測了乳腺腫瘤細胞MCF-7和MDA-MB-231在分別HS作用1h、2h和3h后,細胞內與代謝緊密相關的NADH、FAD熒光強度和氧化還原比率的動態(tài)變化。并且,測量了HS作用、VER-155008作用、他莫昔芬作用以及兩兩聯(lián)合作用對乳腺腫瘤細胞內NADH、FAD和氧化還原比率的影響。所得的結論揭示了細胞代謝變化與HS作用后的乳腺腫瘤細胞的促增殖及增殖抑制間的關系,并進一步明確了靶向HSP70在抗乳腺腫瘤治療中的重大意義�；陔p光子熒光顯微成像的氧化還原比率可用于抗腫瘤治療的療效監(jiān)測、藥物篩選和治療方案優(yōu)化。
【學位授予單位】：福建師范大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.9
【圖文】：

約在ｌ（ｒ４９ＣＷ＾。而且，對于單光子激發(fā)顯微成像，熒光激發(fā)區(qū)域在整個入射光束行逡逑經(jīng)的路徑上，而雙光子激發(fā)成像，熒光激發(fā)區(qū)域僅在焦點附近很小的區(qū)域內產(chǎn)生（如逡逑圖２．１所示）。逡逑２．２．２．２激光掃描共聚焦顯微鏡原理逡逑基光掃描共聚焦顯微鏡主要包括激光光源、掃描裝置、出射小孔、光探測器、逡逑光學顯微鏡和信號處理系統(tǒng)等幾個組成部分。該顯微鏡基于共軛焦點技術設計而成，逡逑使激光光源、被測樣品和探測器處于彼此的共軛位置上。其成像原理如圖２．２所示：逡逑Ｄｅｔｅｃｔｏｒ邋Ｊ逡逑Ｐｉｎｈｏｌｅ逡逑Ｌａｓｃｒ邋，逡逑ｄｉｃｈｒｏｍａｔｉｃ逡逑１ｆｔ逡逑ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＣＴ＾逡逑＼ｆ逡逑Ｆｏｃａｌ逡逑圖２．２激光掃描共聚焦顯微鏡簡化原理圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．２邋Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ邋ｏｆ邋ｃｏｎｆｏｃａｌ邋ｌａｓｅｒ邋ｓｃａｎｎｉｎｇ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ逡逑激發(fā)光被二向色鏡（Ｄｉｃｈｒｏｍａｔｉｃｍｉｒｒｏｒ，ＤＭ）反射后，經(jīng)顯微物鏡聚焦到待測樣逡逑品上。樣品產(chǎn)生的熒光和少量反射激光，經(jīng)物鏡重新收集后到達ＤＭ。其中比激發(fā)逡逑光波長更長的熒光信號經(jīng)ＤＭ和出射小孔后，被探測器收集，而少量的殘余激發(fā)光逡逑和離焦熒光信號則分別被ＤＭ和出射小孔阻擋無法到達探測器。之后，將探測器收逡逑集到的熒光信號轉化為電信號并送入計算機進行處理。逡逑激光共聚焦掃描顯微技術是一種高分辨率的顯微成像技術。在對生物組織和細逡逑胞進行測量時，由于出射小孔的存在，基本上杜絕了來自焦點鄰近區(qū)域的離焦熒光逡逑對成像的千擾

物鏡的焦點處的光子密度最高，雙光子激發(fā)熒光均來自于物鏡的焦點上，所以逡逑雙光子顯微鏡不需要共聚焦針孔來濾除離焦熒光，提高了熒光檢測效率。其原理如逡逑圖２．３所示：逡逑Ｄｅｔｅｃｔｏｒ逡逑Ｕ逡逑Ｌａｓｅｒ邋今邋Ｕ逡逑Ｉ邐Ｄｉｃｈｒｏｍａｔｉｃ逡逑？４逡逑圖２．３雙光子熒光顯微鏡簡化原理圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．３邋Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ邋ｏｆ邋ｔｗｏ－ｐｈｏｔｏｎ邋ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ逡逑雙光子熒光顯微鏡由于其獨特的熒光激發(fā)方式，與共聚焦掃描顯微鏡相比，具逡逑－１７－逡逑

逡逑圖２．４飛秒激光器實物圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．４邋Ｐｈｏｔｏ邋ｏｆ邋ｆｓ邋ｌａｓｅｒ逡逑２．３．２激光掃描共聚焦顯微成像系統(tǒng)逡逑本文采用ＬｅｉｃａＴＣＳＳＰ８邋（Ｇｅｒｍａｎｙ）激光掃描共聚焦顯微鏡進行實驗。該顯微逡逑鏡為倒置熒光顯微鏡，具備明場、熒光、微分千涉等成像功能。其配置多個高倍、逡逑高ＮＡ共聚焦專用復消色差物鏡，內置的固體激光器提供４８８ｎｍ和５５２ｎｍ波長選擇，逡逑包含ＰＭＴ、ＡＰＤ、ＨｙＤ等多個探測器，其中ＨｙＤ為超高靈敏度磷砷化鎵檢測器。逡逑顯微鏡通過棱鏡分光，可檢測熒光波長范圍為４００－８００ｍｎ。該顯微鏡有一個外輸入逡逑口（右圖中矩形框內），我們通過外部光路將飛秒激光導入到儀器內部，實現(xiàn)雙光逡逑子熒光成像。該儀器實物如圖２．５所示：逡逑ｌ．邋％逡逑圖２．５激光掃描共聚焦顯微鏡實物圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．５邋Ｐｈｏｔｏ邋ｏｆ邋ｌａｓｅｒ邋ｓｃａ

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