【摘要】：目的:利用高通量第二代測序技術(nest generation sequencing,NGS)對中國地鼠口腔黏膜癌microRNA進行測序,應用生物信息學技術方法分析,構建miRNA差異表達譜,預測其靶基因,進一步篩選出口腔黏膜癌分子標志物,探討miRNA在口腔黏膜癌的發(fā)生、侵襲、轉移及預后中的調控機制,從比較醫(yī)學的角度為口腔黏膜癌的預防和治療提供理論依據(jù)。方法:利用二甲基苯并蒽(9,10-Dimethy1-1,2-Benzanthracence,DMBA)涂抹法建立中國地鼠口腔黏膜癌模型;通過microRNA測序技術和生物信息分析構建中國地鼠口腔黏膜癌組織和正常組織的差異表達的miRNA表達譜,預測靶基因后進行GO富集分析和KEGG Pathway分析;用RT-qPCR技術驗證部分顯著差異表達的miRNA;用免疫組化和RT-qPCR測定miR-21調控下PTEN/PI3K/AKT通路中PTEN、p-AKT及相關凋亡蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9的表達水平。結果:在成功構建中國地鼠口腔黏膜癌模型的基礎上,對口腔黏膜癌組織和正常組織進行miRNA測序,共得到已知差異miRNA 268個,其中137個表達上調,131個表達下調;進一步分析獲得顯著差異的miRNA共有11個,其中上調的miRNA有8個(miR-542-3p、miR-130b-3p、miR-142-5p、miR-34c-3p、miR-34c-5p、miR-34b-5p、miR-21-3p、miR-21-5p),下調的有3個(miR-504、miR-499-5p、miR-486-3p);對顯著差異表達的miRNA的靶基因預測并進行GO和KEGG Pathway分析后,得到與OSCC相關的生物學過程的GO條目有340條、與細胞組分相關的GO條目有47條以及與分子功能相關的GO條目有46條和15條顯著富集通路,富集的GO條目主要在解剖結構形態(tài)、信號調控、細胞通訊調節(jié)、細胞突起、細胞骨架、神經(jīng)元部分、陰離子配位、轉移酶活性、ATP的結合等方面,極顯著的KEGG通路(q0.01)是Notch信號通路、磷脂酰肌醇信號轉導通路和慢性粒細胞白血病通路。預測得到208個新miRNA,其中有112個表達上調,96個表達下調;進一步深度分析,得到顯著差異的miRNA共有3個(p0.05),其中上調的miRNA有1個,下調的有2個,同樣進行生物信息學分析得到與細胞組分相關的1條GO條目。顯著差異表達的miRNA利用RT-qPCR得到驗證,驗證結果與miRNA-Seq結果高度一致。PTEN/PI3K/AKT通路中PTEN表達下調、p-AKT表達上調;相關凋亡蛋白Bax、Caspase-3和Caspase-9的表達下調、Bcl-2表達上調。結論:本研究利用miRNA-Seq技術對中國地鼠口腔黏膜癌組織和正常組織的miRNA測序,發(fā)現(xiàn)11個miRNA有顯著差異,并預測出3個新的miRNA顯著差異表達,從而導致Notch信號通路、磷脂酰肌醇信號轉導通路和慢性粒細胞白血病通路等15條與口腔黏膜癌相關的信號通路的活化;其中miR-21的兩個成熟變異體miR-21-3p和miR-21-5p的表達顯著增高,其直接靶基因PTEN下調,影響PI3K/AKT通路的活化,進而影響相關凋亡蛋白的表達,從而導致口腔黏膜癌的發(fā)生發(fā)展,miR-21可以作為分子標志物指導OSCC臨床實踐。
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.85
【圖文】：

NomalTR141563 2375 106.9 1.5 1.8 1.2 7.1 BTR141565 1115 50.2 2.1 1.8 1.5 6.7 BCancerTR140679 3500 157.5 1.9 1.6 1.2 8 ATR140681 3940 177.3 1.7 1.7 1.7 9.6 ATR147836 3200 144 2 1.9 1.4 7.8 B注：A. 樣品合格，符合建庫要求；B. 一些指標切合測序要求，可試驗建庫。2.3 測序原始數(shù)據(jù)及小 RNA 序列長度分布2.3.1 miRNA 測序原始數(shù)據(jù)原始數(shù)據(jù)以 FASTQ 格式呈現(xiàn)，示例如下（見圖 1-1）。其中，首行以@開始緊跟 Illumina 測序標識別符和描述文字；第二行呈現(xiàn)堿基序列；第三行以“+”開始緊接 Illumina 測序標識別符；第四行對應堿基測序質量。

.3.3 miRNA 測序數(shù)據(jù)過濾統(tǒng)計匯總將原始數(shù)據(jù)過濾之后統(tǒng)計，結果見表 1-3。從表中可以看出，Cancer 組測得始序列（Raw Reads）為 2.8~3.1×107，過濾后的干凈序列（Clean Reads）為 2.2~2.4×1占總序列的 77%~81%，其中約有98%的Clean Reads 的堿基質量分數(shù)≥20，94%~98≥30，將相同序列合并之后得到的序列種數(shù)（Unique Clean Reads）為 1.0~1.4×10omal 組測得的 Raw Reads 為 2.8~3.0×107，過濾后的 Clean Reads 為 2.1~2.3×107占總序列的 74%~78%，其中約有 98%的 Clean Reads 的堿基質量分數(shù)≥20，94%30，將相同序列合并之后得到的 Unique Clean Reads 為 1.2~1.7×106。綜上所述，究測序數(shù)據(jù)符合分析要求。圖 1-2 數(shù)據(jù)過濾結果圖注：橫坐標表示樣本，縱坐標表示百分比，不同顏色表示不同的過濾指標。圖 1-3 百分比質控圖注：橫坐標表示樣本，縱坐標表示百分比，不同顏色表示不同的統(tǒng)計指標。

.3.3 miRNA 測序數(shù)據(jù)過濾統(tǒng)計匯總將原始數(shù)據(jù)過濾之后統(tǒng)計，結果見表 1-3。從表中可以看出，Cancer 組測得始序列（Raw Reads）為 2.8~3.1×107，過濾后的干凈序列（Clean Reads）為 2.2~2.4×1占總序列的 77%~81%，其中約有98%的Clean Reads 的堿基質量分數(shù)≥20，94%~98≥30，將相同序列合并之后得到的序列種數(shù)（Unique Clean Reads）為 1.0~1.4×10omal 組測得的 Raw Reads 為 2.8~3.0×107，過濾后的 Clean Reads 為 2.1~2.3×107占總序列的 74%~78%，其中約有 98%的 Clean Reads 的堿基質量分數(shù)≥20，94%30，將相同序列合并之后得到的 Unique Clean Reads 為 1.2~1.7×106。綜上所述，究測序數(shù)據(jù)符合分析要求。圖 1-2 數(shù)據(jù)過濾結果圖注：橫坐標表示樣本，縱坐標表示百分比，不同顏色表示不同的過濾指標。圖 1-3 百分比質控圖注：橫坐標表示樣本，縱坐標表示百分比，不同顏色表示不同的統(tǒng)計指標。

【參考文獻】

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本文編號：2796921