【摘要】：目的:利用高通量第二代測序技術(shù)(nest generation sequencing,NGS)對中國地鼠口腔黏膜癌microRNA進行測序,應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)方法分析,構(gòu)建miRNA差異表達譜,預(yù)測其靶基因,進一步篩選出口腔黏膜癌分子標志物,探討miRNA在口腔黏膜癌的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后中的調(diào)控機制,從比較醫(yī)學(xué)的角度為口腔黏膜癌的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。方法:利用二甲基苯并蒽(9,10-Dimethy1-1,2-Benzanthracence,DMBA)涂抹法建立中國地鼠口腔黏膜癌模型;通過microRNA測序技術(shù)和生物信息分析構(gòu)建中國地鼠口腔黏膜癌組織和正常組織的差異表達的miRNA表達譜,預(yù)測靶基因后進行GO富集分析和KEGG Pathway分析;用RT-qPCR技術(shù)驗證部分顯著差異表達的miRNA;用免疫組化和RT-qPCR測定miR-21調(diào)控下PTEN/PI3K/AKT通路中PTEN、p-AKT及相關(guān)凋亡蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9的表達水平。結(jié)果:在成功構(gòu)建中國地鼠口腔黏膜癌模型的基礎(chǔ)上,對口腔黏膜癌組織和正常組織進行miRNA測序,共得到已知差異miRNA 268個,其中137個表達上調(diào),131個表達下調(diào);進一步分析獲得顯著差異的miRNA共有11個,其中上調(diào)的miRNA有8個(miR-542-3p、miR-130b-3p、miR-142-5p、miR-34c-3p、miR-34c-5p、miR-34b-5p、miR-21-3p、miR-21-5p),下調(diào)的有3個(miR-504、miR-499-5p、miR-486-3p);對顯著差異表達的miRNA的靶基因預(yù)測并進行GO和KEGG Pathway分析后,得到與OSCC相關(guān)的生物學(xué)過程的GO條目有340條、與細胞組分相關(guān)的GO條目有47條以及與分子功能相關(guān)的GO條目有46條和15條顯著富集通路,富集的GO條目主要在解剖結(jié)構(gòu)形態(tài)、信號調(diào)控、細胞通訊調(diào)節(jié)、細胞突起、細胞骨架、神經(jīng)元部分、陰離子配位、轉(zhuǎn)移酶活性、ATP的結(jié)合等方面,極顯著的KEGG通路(q0.01)是Notch信號通路、磷脂酰肌醇信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和慢性粒細胞白血病通路。預(yù)測得到208個新miRNA,其中有112個表達上調(diào),96個表達下調(diào);進一步深度分析,得到顯著差異的miRNA共有3個(p0.05),其中上調(diào)的miRNA有1個,下調(diào)的有2個,同樣進行生物信息學(xué)分析得到與細胞組分相關(guān)的1條GO條目。顯著差異表達的miRNA利用RT-qPCR得到驗證,驗證結(jié)果與miRNA-Seq結(jié)果高度一致。PTEN/PI3K/AKT通路中PTEN表達下調(diào)、p-AKT表達上調(diào);相關(guān)凋亡蛋白Bax、Caspase-3和Caspase-9的表達下調(diào)、Bcl-2表達上調(diào)。結(jié)論:本研究利用miRNA-Seq技術(shù)對中國地鼠口腔黏膜癌組織和正常組織的miRNA測序,發(fā)現(xiàn)11個miRNA有顯著差異,并預(yù)測出3個新的miRNA顯著差異表達,從而導(dǎo)致Notch信號通路、磷脂酰肌醇信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和慢性粒細胞白血病通路等15條與口腔黏膜癌相關(guān)的信號通路的活化;其中miR-21的兩個成熟變異體miR-21-3p和miR-21-5p的表達顯著增高,其直接靶基因PTEN下調(diào),影響PI3K/AKT通路的活化,進而影響相關(guān)凋亡蛋白的表達,從而導(dǎo)致口腔黏膜癌的發(fā)生發(fā)展,miR-21可以作為分子標志物指導(dǎo)OSCC臨床實踐。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R739.85
【圖文】：

NomalTR141563 2375 106.9 1.5 1.8 1.2 7.1 BTR141565 1115 50.2 2.1 1.8 1.5 6.7 BCancerTR140679 3500 157.5 1.9 1.6 1.2 8 ATR140681 3940 177.3 1.7 1.7 1.7 9.6 ATR147836 3200 144 2 1.9 1.4 7.8 B注：A. 樣品合格，符合建庫要求；B. 一些指標切合測序要求，可試驗建庫。2.3 測序原始數(shù)據(jù)及小 RNA 序列長度分布2.3.1 miRNA 測序原始數(shù)據(jù)原始數(shù)據(jù)以 FASTQ 格式呈現(xiàn)，示例如下（見圖 1-1）。其中，首行以@開始緊跟 Illumina 測序標識別符和描述文字；第二行呈現(xiàn)堿基序列；第三行以“+”開始緊接 Illumina 測序標識別符；第四行對應(yīng)堿基測序質(zhì)量。

.3.3 miRNA 測序數(shù)據(jù)過濾統(tǒng)計匯總將原始數(shù)據(jù)過濾之后統(tǒng)計，結(jié)果見表 1-3。從表中可以看出，Cancer 組測得始序列（Raw Reads）為 2.8~3.1×107，過濾后的干凈序列（Clean Reads）為 2.2~2.4×1占總序列的 77%~81%，其中約有98%的Clean Reads 的堿基質(zhì)量分數(shù)≥20，94%~98≥30，將相同序列合并之后得到的序列種數(shù)（Unique Clean Reads）為 1.0~1.4×10omal 組測得的 Raw Reads 為 2.8~3.0×107，過濾后的 Clean Reads 為 2.1~2.3×107占總序列的 74%~78%，其中約有 98%的 Clean Reads 的堿基質(zhì)量分數(shù)≥20，94%30，將相同序列合并之后得到的 Unique Clean Reads 為 1.2~1.7×106。綜上所述，究測序數(shù)據(jù)符合分析要求。圖 1-2 數(shù)據(jù)過濾結(jié)果圖注：橫坐標表示樣本，縱坐標表示百分比，不同顏色表示不同的過濾指標。圖 1-3 百分比質(zhì)控圖注：橫坐標表示樣本，縱坐標表示百分比，不同顏色表示不同的統(tǒng)計指標。

.3.3 miRNA 測序數(shù)據(jù)過濾統(tǒng)計匯總將原始數(shù)據(jù)過濾之后統(tǒng)計，結(jié)果見表 1-3。從表中可以看出，Cancer 組測得始序列（Raw Reads）為 2.8~3.1×107，過濾后的干凈序列（Clean Reads）為 2.2~2.4×1占總序列的 77%~81%，其中約有98%的Clean Reads 的堿基質(zhì)量分數(shù)≥20，94%~98≥30，將相同序列合并之后得到的序列種數(shù)（Unique Clean Reads）為 1.0~1.4×10omal 組測得的 Raw Reads 為 2.8~3.0×107，過濾后的 Clean Reads 為 2.1~2.3×107占總序列的 74%~78%，其中約有 98%的 Clean Reads 的堿基質(zhì)量分數(shù)≥20，94%30，將相同序列合并之后得到的 Unique Clean Reads 為 1.2~1.7×106。綜上所述，究測序數(shù)據(jù)符合分析要求。圖 1-2 數(shù)據(jù)過濾結(jié)果圖注：橫坐標表示樣本，縱坐標表示百分比，不同顏色表示不同的過濾指標。圖 1-3 百分比質(zhì)控圖注：橫坐標表示樣本，縱坐標表示百分比，不同顏色表示不同的統(tǒng)計指標。

【參考文獻】

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本文編號：2796921