【摘要】：惡性黑色素瘤作為一種最常見(jiàn)的皮膚癌癥之一,一直是人類不斷試圖攻克的疑難�，F(xiàn)今,對(duì)黑色素瘤的治療僅限于傳統(tǒng)的治療手段,包括免疫治療,化學(xué)治療,手術(shù)等。研究者正在尋找一種更有效和更低毒副作用的治療手段,以待取代傳統(tǒng)的手段。目前,科學(xué)家開(kāi)始使用基因治療這種新型的治療方式,用于很多疾病的治療,尤其是非病毒載體介導(dǎo)的基因治療技術(shù)正在被深入研究。本論文的出發(fā)點(diǎn)即為制備出具有良好生物相容性和高轉(zhuǎn)染效率的非病毒類納米載體,并將其應(yīng)用于黑色素瘤的凋亡基因轉(zhuǎn)染和誘導(dǎo)凋亡的研究。主要內(nèi)容如下：以具有良好生物相容性的聚乙烯亞胺(polyethyleneimine, PEI)和殼聚糖(chitosan,CS)為基礎(chǔ),分別評(píng)價(jià)了聚乙烯亞胺與殼聚糖／三聚磷酸鈉(sodiumtripolyphosphate, TPP)兩種納米載體的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和生物相容性等指標(biāo),發(fā)現(xiàn)兩者作為A375細(xì)胞(人類惡性黑色素瘤細(xì)胞)的轉(zhuǎn)染載體均不太理想。最終,借助細(xì)胞穿膜肽(trans-activating transcriptional activator, TAT),我們制備出了具有較高轉(zhuǎn)染效率和低細(xì)胞毒性的非病毒類納米復(fù)合物載體PEI-SMCC-TAT (polyethyleneimine-sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate-TAT, PST),同時(shí)結(jié)合P53正向凋亡調(diào)節(jié)因子基因(p53 upregulated modulator of apoptosis, PUMA),評(píng)價(jià)了新型納米載體PST轉(zhuǎn)染凋亡基因并誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序的效果,初步評(píng)價(jià)了這種治療黑色素瘤方法的可行性,也從一定程度上為基于高分子的非病毒納米載體用于基因治療黑色素瘤的后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。生物相容性分析結(jié)果顯示,PEI/DNA復(fù)合物的細(xì)胞毒性強(qiáng)于PST/DNA復(fù)合物給細(xì)胞帶來(lái)的毒性。而CS/TPP-DNA復(fù)合物的生物相容性最好。粒度分析結(jié)果顯示,在N/P比從4到50的范圍內(nèi),PEI/DNA復(fù)合物的粒徑尺寸均穩(wěn)定在170 nm左右。CS/TPP-DNA納米載體系統(tǒng)則具有較大的粒徑。在不同體積比條件下,其粒徑均在350 nm左右。這也是殼聚糖作為載體只具有低細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的重要因素之一。在N/P達(dá)到50時(shí),PST/DNA則呈現(xiàn)出200 nm以下的粒徑大小。凝膠阻滯分析結(jié)果顯示,PEI、CS/TPP、PST均具有良好的核酸阻滯能力。傅里葉變換紅外光譜則顯示PEI聚合物骨架已成功通過(guò)交聯(lián)劑SMCC修飾上TAT穿膜肽。此外,本論文還通過(guò)離子凝膠法制備了CS/TPP納米粒子,討論了pH值、體積比等因素對(duì)其粒子形貌和粒徑的影響。采用粒度分析、生物相容性分析、凝膠阻滯分析等研究了其作為納米載體的特性,結(jié)果表明其對(duì)HEK293T細(xì)胞與A375細(xì)胞只具有較低的轉(zhuǎn)染效率。本論文最終合成了在A375細(xì)胞中具有增強(qiáng)的轉(zhuǎn)染效率的PST納米載體,系統(tǒng)地考察了不同合成因素對(duì)新型納米載體PST組成和轉(zhuǎn)染效率的影響,如TAT與Sulfo-SMCC的加入量和PST的N/P(大于20)對(duì)其轉(zhuǎn)染效率的影響等。最后,將最佳條件合成的PST納米載體攜帶PUMA凋亡基因,通過(guò)雙染Annexin-FITC/DAPI和Annexin-APC/7-AAD,進(jìn)行流式細(xì)胞儀的凋亡分析和細(xì)胞膜細(xì)胞核染色情況分析,考察PUMA誘導(dǎo)的黑色素瘤細(xì)胞的凋亡情況。綜述所述,本論文分別考察了PEI, CS/TPP作為納米載體的轉(zhuǎn)染能力,并進(jìn)一步制備了具有高轉(zhuǎn)染效率的新型納米載體PST。通過(guò)各類表征測(cè)試,制備出了具備良好生物相容性、較高轉(zhuǎn)染效率的高分子納米載體PST。最終,將PST攜帶凋亡基因PUMA對(duì)黑色素瘤細(xì)胞進(jìn)行凋亡誘導(dǎo),探討將其應(yīng)于基因治療的潛在價(jià)值,為后續(xù)的黑色素瘤基因治療研究提供新的途徑。
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R739.5;R450

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