【摘要】：目的:課題組前期研究發(fā)現(xiàn)miR-30a是靶向LRP6的潛在miRNA。為了進(jìn)一步研究miR-30a靶向LRP6對口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖的影響及作用機(jī)制,本研究在口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系水平上探討miR-30a表達(dá)與LRP6表達(dá)的相關(guān)性;以HSC-3、Cal-27細(xì)胞為研究對象,檢測miR-30a靶向抑制LRP6對口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖的影響;本研究將可能發(fā)現(xiàn)miR-30a/LRP6信號作為新的口腔鱗狀細(xì)胞癌致病機(jī)制,并為口腔鱗狀細(xì)胞癌及其他惡性腫瘤的診斷治療提供新思路和新靶標(biāo)。方法:(1)分別應(yīng)用Western blot和QPCR檢測6株口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系HSC-4、HSC-3、Cal-27、Um1、Um2、SCC9和正�？谇击[狀細(xì)胞HOK中LRP6和miR-30a的表達(dá),利用Pearson法分析miR-30a與LRP6表達(dá)的相關(guān)性;(2)TragetScan在線生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-30a與LRP6靶向調(diào)控關(guān)系;雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-30a與LRP6靶向作用;HSC-3和Cal-27細(xì)胞中過表達(dá)miR-30a分別利用Western blot和QPCR檢測LRP6蛋白和mRNA表達(dá)變化;(3)構(gòu)建過表達(dá)LRP6的pcDNA3.1-LRP6質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染HSC-3和Cal-27細(xì)胞,建立過表達(dá)LRP6細(xì)胞株;MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)分別檢測過表達(dá)miR-30a及miR-30a聯(lián)合外源過表達(dá)LRP6對HSC-3和Cal-27細(xì)胞增殖和克隆形成能力影響;(4)轉(zhuǎn)染siLRP6構(gòu)建沉默LRP6的HSC-3和Cal-27細(xì)胞,MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)分別檢測沉默LRP6對HSC-3和Cal-27細(xì)胞增殖和克隆形成能力影響;(5)Western blot檢測沉默LRP6、過表達(dá)miR-30a及過表達(dá)miR-30a聯(lián)合外源表達(dá)LRP6后LRP6及其下游Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵蛋白β-catenin、Cyclin D1、FGF8表達(dá)變化。結(jié)果:(1)Western blot檢測發(fā)現(xiàn)LRP6在正�？谇击[狀細(xì)胞HOK中低表達(dá),在6株口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系HSC-4、HSC-3、Cal-27、Um1、Um2、SCC9中相對高表達(dá),QPCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-30a在正�？谇击[狀細(xì)胞HOK中高表達(dá),在6株口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系HSC-4、HSC-3、Cal-27、Um1、Um2、SCC9中普遍低表達(dá),兩者表達(dá)水平呈顯著的負(fù)相關(guān);(2)在線數(shù)據(jù)庫TargetScan發(fā)現(xiàn)LRP6是miR-30a的潛在靶標(biāo),LRP6的3’UTR中含有與miR-30a互補(bǔ)結(jié)合的核苷酸位點(diǎn);雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染miR-30a后pmirGLO-LRP6-3'UTR-WT組熒光素酶活性顯著下降,而將LRP6的3'UTR中miR-30a結(jié)合位點(diǎn)突變后,其熒光素酶活性無顯著變化;HSC-3、Cal-27細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-30a后LRP6 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著下調(diào),證實(shí)在口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中LRP6確實(shí)是miR-30a的靶標(biāo);(3)HSC-3、Cal-27細(xì)胞過表達(dá)miR-30a顯著地抑制細(xì)胞增殖和克隆形成能力;過表達(dá)miR-30a聯(lián)合外源表達(dá)LRP6后細(xì)胞增殖和克隆形成能力部分恢復(fù);(4)HSC-3、Cal-27細(xì)胞沉默LRP6后細(xì)胞增殖能力和克隆形成能力均被顯著抑制,得到與過表達(dá)miR-30a一致變化;(5)在HSC-3細(xì)胞中,miR-30a能夠靶向抑制LRP6及其下游Wnt/β-catenin信號通路蛋白β-catenin、Cyclin D1、FGF8的表達(dá)。結(jié)論:miR-30a能夠靶向抑制LRP6及其下游Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來發(fā)揮抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌的作用,揭示口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生進(jìn)展?jié)撛谛聶C(jī)制,為其臨床診斷和治療提供了新思路和新靶標(biāo)。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R739.8
【圖文】：

P6 異常高表達(dá)與多種人類癌癥類型的發(fā)生發(fā)口腔鱗狀細(xì)胞癌[23-25]。本課題利用 Western bl HSC-4、HSC-3、Cal- 27、Um1、Um2、SCCRP6 表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LRP6 正�？谇击[狀細(xì)胞細(xì)胞癌細(xì)胞系中高表達(dá)（圖 1.1）。LRP6 在 HS高，在 HSC-4、Um1、Um2 和 SCC9 細(xì)胞系 Cal-27 細(xì)胞系作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究細(xì)胞模型。miR-30a 作為一個(gè)抑癌因子在多種惡性腫瘤中[35, 36]、腎癌[39]及口腔鱗狀細(xì)胞癌[33]等。本課題癌細(xì)胞系 HSC-4、HSC-3、Cal- 27、Um1、系 HOK 中 miR-30a 表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn) miR-30a 達(dá)，在 6 株口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中普遍低 表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（圖 1.3）。

腔鱗狀細(xì)胞系 HOK 和 6 株口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)表達(dá)水平；與 HOK 相比，P< 0.05 Relative miR-30a expression levels (normalizedCR in normal oral squamous cell line HOK and cell lines; compared with HOK, P<0.05

26腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株中 miR-30a 與 LRP6 表達(dá)呈顯3 The expression of miR-30a was inversely correlated protein expression in OSCC cell lines.細(xì)胞癌細(xì)胞中 LRP6 是 miR-30a 的靶標(biāo)鱗狀細(xì)胞癌中是否由于 miR-30a 異常表達(dá)進(jìn)而導(dǎo)線數(shù)據(jù)庫 TargetScan 發(fā)現(xiàn) LRP6 是 miR-30a 的潛在 miR-30a 互補(bǔ)結(jié)合的核苷酸位點(diǎn)（圖 2.1）。為了進(jìn)一構(gòu)建了 pmirGLO-LRP6-3'UTR-WT/Mut 質(zhì)粒，經(jīng)雙

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 李艷;傅蕾;符小玉;李榮華;彭仕芳;;微小RNA-30a通過靶向調(diào)控FOXA1的表達(dá)抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖[J];中華肝臟病雜志;2017年09期

本文編號：2795426