【摘要】：研究背景與目的肺癌約占全部惡性腫瘤死亡率的20%,是目前全球癌癥死亡的主要原因,其中超過(guò)80%的是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)。世界衛(wèi)生組織(WHO)公布的資料顯示：肺癌無(wú)論是發(fā)病率(120萬(wàn)/年)還是死亡率(110萬(wàn)/年)均居全球癌癥首位,并且其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)。根據(jù)我國(guó)腫瘤防治辦公室公布的資料：從上世紀(jì)70年代至今,我國(guó)肺癌死亡率上升了近5倍。大量的研究調(diào)查顯示：吸煙與肺癌的發(fā)病密切相關(guān),吸煙者比不吸煙者肺癌發(fā)生的幾率高近10倍。中國(guó)目前擁有著超過(guò)全球1/3的吸煙人群,由于肺癌發(fā)病率變化與吸煙率相比約滯后20-30年,在不久的將來(lái),肺癌發(fā)病和死亡所占的比重在全球范圍內(nèi)將更加突出。由此可見,肺癌已成為威脅全球及我國(guó)居民生命和健康的重要疾病之一,是函待解決的重大公共衛(wèi)生問題。隨著肺癌分子生物學(xué)研究水平的不斷進(jìn)步,關(guān)于非小細(xì)胞肺癌遺傳基因方向的研究也越來(lái)越多。肺癌作為一種多因素、多基因參與的復(fù)雜性狀疾病,其病因、發(fā)病機(jī)制及預(yù)后影響因素尚不完全清楚,臨床診斷及治療技術(shù)水平仍需不斷提高。例如,占所有肺癌80%以上的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)其5年生存率在美國(guó)為15%,在歐洲為10%,而在發(fā)展中國(guó)家僅為8.9%。盡管NSCLC預(yù)后判斷和劃分的主要依據(jù)仍然是臨床分期和病理組織學(xué)類型,然而,具有相同臨床特征的NSCLC患者,采用同樣的治療手段,其預(yù)后情況卻可能有很大的差異。以鉑類化療為例,鉑類藥物是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)化學(xué)治療的主要和首選藥物,然而以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療方案(如與紫杉醇等聯(lián)合)對(duì)晚期NSCLC的有效率僅約17-37%左右,中位生存期為6.7-11.3月,人們對(duì)患者個(gè)體間化療應(yīng)答差異產(chǎn)生的原因還不十分清楚,然而最新的研究提示我們遺傳因素可能在其中起到了關(guān)鍵作用。因此,通過(guò)生物標(biāo)志物對(duì)NSCLC患者預(yù)后情況進(jìn)行預(yù)測(cè),并采取針對(duì)性的個(gè)體化治療(personalized therapy),將有助于改善生存質(zhì)量,延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間。研究表明,具有相同臨床特征及治療手段的患者,其生存時(shí)間的差異一方面與個(gè)體體質(zhì)有關(guān),另一方面也可能受到包括遺傳變異在內(nèi)的遺傳因素的影響,因此遺傳因素具有成為潛在新的預(yù)后預(yù)測(cè)標(biāo)志物。人類基因組計(jì)劃(Human Genome Project, HGP)研究結(jié)果表明,不同個(gè)體的基因組99.9%是一樣的,在序列上僅存在極小(0.1%)的遺傳差異,主要是單核苷酸多態(tài)性(SNPs)。SNP是指基因水平上由單個(gè)核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性,其在群體中的頻率不小于1%,包括單堿基轉(zhuǎn)換、顛換、插入或缺失等變化。由于在人類基因組中,三、四等位基因(allele)形式的SNP非常罕見,因此SNP也簡(jiǎn)單指雙等位基因,其兩個(gè)不同等位基因的組合稱為基因型(genotype)。人類基因組中存在數(shù)量巨大的SNPs,其中一些可能影響相應(yīng)基因的表達(dá)、所編碼蛋白的結(jié)構(gòu)或功能,進(jìn)而影響個(gè)體催患疾病的可能性、對(duì)藥物的反應(yīng)性以及不同患病個(gè)體的預(yù)后。SNP在基因序列中的高密度、代表性、遺傳穩(wěn)定性,以及檢測(cè)的易實(shí)現(xiàn)等特點(diǎn)體現(xiàn)了新一代遺傳標(biāo)記的優(yōu)越性,成為繼第一代限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記和第二代微衛(wèi)星標(biāo)記后的第三代基因遺傳標(biāo)記,并被迅速接受從而成為遺傳研究領(lǐng)域中極為活躍的內(nèi)容。根據(jù)其在基因中的位置,SNP可分為基因編碼區(qū)SNP (Coding SNP, cSNP)和基因調(diào)控區(qū)SNP(Regulatory SNP, rSNP)。其中,cSNP根據(jù)是否改變編碼的氨基酸又可分為同義cSNP (Synonymous cSNP)和非同義cSNP (Non-synonymous cSNP)。同義cSNP指堿基序列的改變并不影響蛋白質(zhì)的氨基酸序列,而非同義cSNP可改變編碼的氨基酸殘基的種類,從而使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化。此外,出現(xiàn)在調(diào)控區(qū)的rSNP則可以通過(guò)影響與轉(zhuǎn)錄因子或miRNA的結(jié)合,引起基因表達(dá)水平的改變或mRNA的穩(wěn)定性及翻譯過(guò)程的變化,進(jìn)而影響細(xì)胞正常功能。因此,這些潛在功能性SNPs通常被優(yōu)先選擇用于探討與疾病發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系,從而為包括肺癌在內(nèi)的惡性腫瘤的防制及臨床治療決策提供科學(xué)依據(jù)。研究己發(fā)現(xiàn),細(xì)胞周期紊亂是腫瘤發(fā)生最主要的機(jī)制,細(xì)胞惡性化的核心事件是正常的細(xì)胞周期進(jìn)程被破壞使腫瘤細(xì)胞順利進(jìn)入細(xì)胞周期進(jìn)程,相關(guān)調(diào)控蛋白和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)生改變,失去分化能力,從而發(fā)生惡性增殖。除細(xì)胞周期調(diào)控因子外,趨化因子是另一類與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的家族。趨化因子是一類與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的家族。趨化因子是一類分子量8-12 kD、至少有2個(gè)保守半肌氨酸(Cys)組成的分泌型單鏈蛋白質(zhì),能夠激活和趨化白細(xì)胞,參與免疫調(diào)節(jié)和免疫病理反應(yīng)。根據(jù)其N端Cys順序,趨化因子可分為4類：CXC (α)、CC(β), C(γ)種和CX3C (δ)。趨化因子主要通過(guò)與其特定的G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合,參與包括造血細(xì)胞的生成、白細(xì)胞的遷移與歸巢、胚胎的發(fā)育等許多正常生命活動(dòng),同時(shí)也參與包括炎性疾病、病毒感染、移植排斥、惡性腫瘤等眾多病理過(guò)程。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中,不同的趨化因子起著不同的作用：一部分趨化因子能促進(jìn)腫瘤的增殖,促進(jìn)血管形成,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞移動(dòng)和粘附內(nèi)皮細(xì)胞,加速腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移；一部分趨化因子能抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和血管形成,激發(fā)機(jī)體特異性和非特異性免疫應(yīng)答,從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。研究表明,多數(shù)腫瘤可分泌多種異常高水平的趨化因子,其表達(dá)譜的差異可決定腫瘤浸潤(rùn)白細(xì)胞的種類與浸潤(rùn)程度,并且腫瘤轉(zhuǎn)移和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)有著相似的形成過(guò)程,涉及到細(xì)胞滾動(dòng)、黏附和跨內(nèi)皮遷移等。此外,己有多個(gè)報(bào)道發(fā)現(xiàn),CXC(a)和CC(p)等趨化因子的表達(dá)失調(diào)可影響包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展及預(yù)后。例如,肺癌細(xì)胞系中存在CXCL12的表達(dá)升高,且CXCL12的表觀沉默是NSCLC預(yù)后良好的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子,CCL22的高表達(dá)與肺癌的進(jìn)展及復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān),高CXCR4/CXCL12表達(dá)水平與肺癌疾病進(jìn)展相關(guān)聯(lián),并提示較差的預(yù)后(12,25,42-44)。體外和體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)表明,在腫瘤微環(huán)境中,CXCR4/CXCL12相互作用可能促進(jìn)局部腫瘤的生長(zhǎng),而CXCR4高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞具有更大的侵襲性和轉(zhuǎn)移潛力。趨化因子CXCL12即基質(zhì)衍生因子(stromal cell-derived factor, SDF-1),在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、淋巴細(xì)胞的發(fā)育成熟及歸巢、調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)、促進(jìn)血管生成等方面發(fā)揮著重要的作用。目前已知CXCL12在多種惡性腫瘤患者體內(nèi)高表達(dá),如乳腺癌、黑色素瘤、胃癌、結(jié)腸癌及肺癌等。但在NSCLC患者中表達(dá)情況目前研究相對(duì)較少。2010年Imai等報(bào)道,CXCL12在肺癌細(xì)胞系中表達(dá)明顯高于正常支氣管上皮細(xì)胞；小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株與NSCLC細(xì)胞相比其表達(dá)無(wú)明顯差異；在NSCLC腫瘤組織中CXCL12表達(dá)明顯高于支氣管上皮正常組織,研究還發(fā)現(xiàn)NSCLC患者體內(nèi)CXCL12表達(dá)與CXCR4和CXCR7表達(dá)相關(guān)性較低。另外有研究發(fā)現(xiàn)在女性、不吸煙、腺癌患者中CXCL12表達(dá)明顯升高,結(jié)合EGFR與CXCL12的關(guān)系分析,發(fā)現(xiàn)伴有EGFR突變的肺腺癌患者中CXCL12表達(dá)明顯較野生型患者高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,由于試驗(yàn)中EGFR檢測(cè)患者例數(shù)較少,CXCL12與EGFR具體表達(dá)相關(guān)性有待于進(jìn)一步研究。針對(duì)NSCLC Ⅰ,Ⅱ期患者CXCL12表達(dá)情況與預(yù)后分析研究發(fā)現(xiàn),CXCL12高表達(dá)組與低表達(dá)組患者預(yù)后總生存期無(wú)明顯差異,而對(duì)于晚期NSCLC患者,CXCL12表達(dá)與患者預(yù)后總生存期關(guān)系的研究報(bào)道較少。有研究指出CXCL12表達(dá)高的肺腺癌患者預(yù)后較差,具體原因及機(jī)制目前未見明確報(bào)道,可能與CXCL12異常甲基化及其受體異常表達(dá)有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn),CXCL12在不同性別間作用不同,可能與男性患者中CXCL12異常甲基化表達(dá)缺失明顯高于女性有關(guān),具體機(jī)制也有待于研究證實(shí)。在NSCLC的CXCL12高表達(dá)患者中,假設(shè)如果阻止CXCL12與其受體結(jié)合從而阻斷其信號(hào)傳導(dǎo)通路,是否可以抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移呢?Phillips等通過(guò)對(duì)嚴(yán)重免疫缺陷小鼠使用CXCL12抗體來(lái)中和小鼠體內(nèi)CXCL12水平,從而抑制了腫瘤轉(zhuǎn)移,這一實(shí)驗(yàn)證明了這一想法的可行性。體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)可以使用siRNA或抗CXCL12抗體來(lái)抑制肺癌細(xì)胞增殖。目前為止,對(duì)于NSCLC特別是CXCL12高表達(dá)患者,通過(guò)抑制CXCL12而阻斷其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是否可以治療肺癌,該通路阻斷后對(duì)人體正常生理機(jī)能有無(wú)影響未發(fā)現(xiàn)有明確報(bào)道,有待于深入研究。在編碼CXCL12的基因3’轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū)存在第801位的鳥嘌呤(G)向腺嘌呤(A)突變的多態(tài)性(記為CXCL12-3'G801A, rs1801157),該基因位點(diǎn)的多態(tài)性與哮喘、HIV感染和移植排斥反應(yīng)等的相關(guān)性已有報(bào)道。近年來(lái),多項(xiàng)研究表明CXCL12-3'G801A基因多態(tài)性參與腫瘤形成、發(fā)展、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移的多個(gè)過(guò)程。而侵襲和轉(zhuǎn)移又是導(dǎo)致惡性腫瘤治療失敗的主要原因。前期研究表明前列腺癌患者中趨化因子CXCL12801核苷酸GA+AA基因型明顯高于正常健康人群,而且CXCL12 G801A基因型患者有更多的淋巴轉(zhuǎn)移。但是在對(duì)于CXCL12-G801A基因多態(tài)性在非小細(xì)胞肺癌的影響方面的研究極少,目前全球范圍內(nèi)僅見2篇相關(guān)報(bào)道。綜上所述,一系列證據(jù)表明,趨化因子家族中相關(guān)基因表達(dá)或功能的改變?cè)诎∟SCLC在內(nèi)的腫瘤發(fā)生發(fā)展及預(yù)后中發(fā)揮重要作用。然而,迄今為止,有關(guān)上述基因的多態(tài)性與NSCLC的預(yù)后分析還較少,己發(fā)表的2篇文獻(xiàn)也僅是關(guān)注少數(shù)基因少數(shù)位點(diǎn)并僅針對(duì)中亞及臺(tái)灣人群的研究。上述研究對(duì)于腺癌EGFR突變與CXCL12-G801A的關(guān)系也未做研究,同時(shí)對(duì)于中國(guó)內(nèi)陸地區(qū),CXCL12-G801A基因多態(tài)性對(duì)于中國(guó)漢族人群非小細(xì)胞肺癌的影響未見報(bào)道,本研究的目的就是通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌CXCL12-G801A基因型分布,并進(jìn)一步探討CXCL12-G801A基因多態(tài)性對(duì)我國(guó)漢族人群非小細(xì)胞肺癌易感性和疾病進(jìn)展、預(yù)后的影響。研究方法：1.從我院2012年1月到2014年1月入院治療的患者中選取408例病理確診為非小細(xì)胞肺癌的患者,另外招募303個(gè)健康個(gè)體一起進(jìn)行該項(xiàng)研究(表1)。非小細(xì)胞肺癌患者沒有接受術(shù)前放療或化療。招募的303名健康志愿者均來(lái)自周邊省、市的漢族居民,并且與入組非小細(xì)胞肺癌患者之間沒有任何血緣關(guān)系。收集非小細(xì)胞肺癌組與健康組患者年齡、性別及吸煙史。研究計(jì)劃獲上述參與單位倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所以受試者均知情并同意參與。2.分別抽取空腹外周血5ml,采用蛋白酶K消化-飽和氯化鈉鹽析法提取兩組研究對(duì)象的基因組DNA,采用PCR-RFLP分析方法和PIRA-PCR方法檢測(cè)CXCL12-G801A的三種基本基因型(G/G,A/A和A/G)頻率分布。3.采用SPSS1 8.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD,x±S)表示。兩樣本均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)；組間等位基因型或等位基因的比較采用χ2檢驗(yàn)。P0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異。結(jié)果：1.CXCL12-G801A基因型判斷突變的等位基因A經(jīng)MspI酶切反應(yīng)后,G/G純合子被切為202及100 bp兩條帶,而A/A純合子仍為302 bp,A/G雜合子則顯示為302,202及100 bp 3條帶(圖1)2.病例組和健康對(duì)照組的一般資料非小細(xì)胞肺癌患者組與健康對(duì)照組間的性別構(gòu)成無(wú)顯著性差異(χ23.384,P=0.066)。3.兩組患者的年齡情況病例組和對(duì)照組平均年齡分別是61.31±10.02歲和62.50±9.86歲。兩組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.115)。非小細(xì)胞肺癌患者組與健康對(duì)照組間的年齡構(gòu)成無(wú)顯著性差異。4. CXCL12-G801A SNPs與非小細(xì)胞肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的分析病例組和對(duì)照組CXCL12-G801A G/G基因型的頻率分別是59.56%和66.37%。病例組和對(duì)照組CXCL12-G801A A/A基因型的頻率分別為10.29%和7.92%。病例組和對(duì)照組CXCL12-G801A A/G雜合的頻率分別為30.15%和25.74%。病例組和對(duì)照組CXCL12-G801A三種基因型比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.527,P=0.171)。5. CXCL12-G801A等位基因分布與非小細(xì)胞肺癌易感性的關(guān)系CXCL12-G801A基因型及等位基因在健康對(duì)照組(χ2=0.880,P=0.644)及NSCLC組(χ2=0.835,P=0.659)的分布均處于Hardy-Weinberg平衡,NSCLC組CXCL12-G801A多態(tài)性等位基因G及A頻率分別是74.63%、79.21和25.37%、20.79%, CXCL12-G801A多態(tài)性等位基因G及A頻率與健康對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.495,P=0.114)。6.通過(guò)病例組和對(duì)照組的研究,我們也沒有觀察到與CXCL12-G801A多態(tài)性顯著關(guān)聯(lián)的臨床參數(shù)和流行的基因型。7.根據(jù)病理分型和肺癌分期分析CXCL12-G801A的三種基本基因型(G/G, A/A,A/G)分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2= 1.349, P=0.509; x2= 12.141, P=0.059)。 CXCL12-G801A基因多態(tài)性與非小細(xì)胞肺癌的病理分型和肺癌分期無(wú)相關(guān)性。8、CXCL12-G801A的三種基本基因型(G/G, A/A, A/G)與肺腺癌的EGFR突變無(wú)相關(guān)性(χ2=1.196,P=0.550)。9、非小細(xì)胞肺癌中,CXCL12-G801A的三種基本基因型(G/G, A/A,A/G)1年生存率分別為G/G組33.75%、G/A組32.52%,A/A組33.33%,三種基因型1年生存率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.096,P=0.213)。結(jié)論：1. CXCL12-G801A的三種基本基因型(G/G, A/A, A/G)分布與中國(guó)漢族人群非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病率無(wú)相關(guān)性。CXCL12-G801A基因多態(tài)性和中國(guó)漢族人群非小細(xì)胞肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)。CXCL12-G801A基因多態(tài)性不是中國(guó)漢族人群非小細(xì)胞肺癌的危險(xiǎn)因素。2. CXCL12-G801A多態(tài)性等位基因A和G的分布與中國(guó)漢族人群非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病率無(wú)相關(guān)性。CXCL12-G801A多態(tài)性等位基因A和G的分布不是中國(guó)漢族人群非小細(xì)胞肺癌的危險(xiǎn)因素。3. CXCL12-G801A的三種基本基因型(G/G,A/A,A/G)與中國(guó)漢族人群非小細(xì)胞肺癌的病理分型和肺癌分期無(wú)相關(guān)性。4. CXCL12-G801A的三種基本基因型(G/G,A/A,A/G)與中國(guó)漢族人群肺腺癌的EGFR突變無(wú)相關(guān)性。5. CXCL12-G801A的三種基本基因型(G/G, A/A, A/G)與非小細(xì)胞肺癌1年生存率無(wú)相關(guān)性。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R734.2
【圖文】：

圖１ＣＸＣＬ１２－３＇Ｇ８０１Ａ多態(tài)性酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖逡逑Ｍ：邋ＤＮＡ邋ｍａｒｋｅｒ邋；逡逑Ｌｉｎｅ９：邋ＣＸＣＬ１２－３＇８０１Ａ／Ａ邋純合子；逡逑Ｌｉｎｅ２、５、６、８：邋ＣＸＣＬ１２－３’８０１Ｇ／Ｇ邋純合子；逡逑Ｌｉｎｅｌ、３、４、７：邋ＣＸＣＬ１２－３’８０１ＧＡ

圖１ＣＸＣＬ１２－３＇Ｇ８０１Ａ多態(tài)性酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖逡逑Ｍ：邋ＤＮＡ邋ｍａｒｋｅｒ邋；逡逑Ｌｉｎｅ９：邋ＣＸＣＬ１２－３＇８０１Ａ／Ａ邋純合子；逡逑Ｌｉｎｅ２、５、６、８：邋ＣＸＣＬ１２－３’８０１Ｇ／Ｇ邋純合子；逡逑Ｌｉｎｅｌ、３、４、７：邋ＣＸＣＬ１２－３’８０１ＧＡ

本文編號(hào)：2794571