【摘要】：第一部分RACK1與食管鱗狀細(xì)胞癌化療耐藥的關(guān)系及相關(guān)機(jī)制的初步探討背景食管癌是全球最常見和最難治的惡性腫瘤之一。食管惡性腫瘤組織學(xué)類型以上皮來源的最為多見,常見病理類型為腺癌和鱗癌兩種,其中以鱗癌更為常見。我國(guó)食管癌中鱗癌占90%以上,腺癌占7%,其他病理類型少見。近幾十年來,隨著外科手術(shù)技術(shù)的逐步提高,新輔助治療手段的日益改進(jìn),靶向藥物的不斷研發(fā),免疫治療的臨床轉(zhuǎn)化,食管癌總體治療療效水平有了顯著的改善。大多數(shù)的食管癌患者確診時(shí)處于進(jìn)展期或者晚期,只能接受化療、放療、免疫治療、輔助治療等。只有對(duì)化學(xué)治療藥物敏感的患者才能從化療中獲益,而化療耐藥的發(fā)生嚴(yán)重影響了治療療效。所以,尋找影響食管癌化療藥物敏感度的指標(biāo)及其在化療耐藥中的潛在機(jī)制勢(shì)在必行。1989年,RACK1首次從雞基因組DNA集群和人類B淋巴母細(xì)胞系cDNA文庫(kù)中克隆出,它與G蛋白的β亞基具有高度的同源性。RACK1是色氨酸-天冬氨酸重復(fù)蛋白家族中的一員,采用了高度保守的七層折疊的β螺旋槳結(jié)構(gòu)。作為錨定蛋白,RACK1可以與多種蛋白激酶或膜結(jié)合受體結(jié)合,運(yùn)輸結(jié)合蛋白,調(diào)節(jié)結(jié)合蛋白的活性,參與轉(zhuǎn)錄翻譯的過程。RACK1基因在細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂、分化等多種生理活動(dòng)和細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移等病理過程中均扮演著不可或缺的角色。研究表明,在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、肝細(xì)胞肝癌、結(jié)直腸癌等多種癌癥中,與周圍正常組織相比,RACK1呈現(xiàn)了差異性表達(dá)。我們之前的研究證實(shí),RACK1與食管鱗癌的預(yù)后相關(guān),并能促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生。研究表明,RACK1可以調(diào)節(jié)部分凋亡相關(guān)基因和藥物敏感性相關(guān)基因,并與腫瘤的化療敏感性相關(guān)。另外,近期研究發(fā)現(xiàn),腫瘤中RACK1的表達(dá)水平與肝細(xì)胞肝癌的化療耐藥有一定的關(guān)系。研究目的本項(xiàng)研究旨在探討RACK1基因?qū)ca109、EC9706等食管鱗癌細(xì)胞系的克隆能力、增殖能力、凋亡能力及化療藥物作用的敏感性的影響,并進(jìn)一步探究RACK1與食管鱗癌化療耐藥之間的潛在作用機(jī)制,為改善食管癌化療耐藥提供新的方向和思路。研究方法1.細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:在37℃恒溫、穩(wěn)定C02水平(含5%)的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)Eca109和EC9706,每隔2-3天進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將載有shRNA或者shNC或者靶向RACK1基因開放閱讀框的質(zhì)粒用脂質(zhì)體2000溶劑分別轉(zhuǎn)染至Eca109和EC9706細(xì)胞中。敲減或過表達(dá)的細(xì)胞需繼續(xù)培養(yǎng)48-72h,確定轉(zhuǎn)染效率并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株:確定Eca109和EC9706細(xì)胞適宜的G418篩選濃度。使用G418藥物濃度為400ug/ml(篩選濃度)的培養(yǎng)液培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞14天,后續(xù)使用G418藥物濃度為300ug/ml(維持濃度)的培養(yǎng)液維持培養(yǎng),篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。3.檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率:轉(zhuǎn)染后的食管鱗癌細(xì)胞中RACK1表達(dá)水平通過實(shí)時(shí)PCR和免疫印跡實(shí)驗(yàn)在RNA和蛋白質(zhì)兩個(gè)層次上進(jìn)行檢測(cè),證實(shí)Eca109和EC9706中RACK1過表達(dá)或敲減的效率。4.克隆形成實(shí)驗(yàn):培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞被胰蛋白酶溶液消化成單細(xì)胞懸液,吹打均勻,每孔加入2ml細(xì)胞懸液,按照250個(gè)/ml的密度將細(xì)胞種板至六孔板內(nèi)。在37℃恒溫、5%C02的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行14天的培養(yǎng)后,加入無水乙醇固定10分鐘,后用濃度為0.1%的結(jié)晶紫染料染色30分鐘。計(jì)算形成克隆數(shù),包含50個(gè)細(xì)胞及以上的細(xì)胞集團(tuán)可視為一個(gè)克隆�？寺⌒纬陕手傅氖寝D(zhuǎn)染細(xì)胞(敲減或過表達(dá)RACK1基因)形成的克隆數(shù)除以對(duì)照組細(xì)胞(未轉(zhuǎn)染)形成的克隆數(shù)。5.化療耐藥實(shí)驗(yàn):將轉(zhuǎn)染細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞按照1X 104個(gè)/孔密度種板至96孔板內(nèi),待細(xì)胞平鋪均勻,每孔加入不同濃度的順鉑(1-320umol/L)和5-氟尿嘧啶(1-10umol/L)培養(yǎng)48至72小時(shí)。CCK8實(shí)驗(yàn)用來檢測(cè)細(xì)胞的活性。將細(xì)胞稀釋至5×104個(gè)/ml,均勻種板至六孔板中,恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h,加入化療藥物順鉑(1-320umol/L)或5-氟尿嘧啶(1-10umol/L)。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72小時(shí)后,用以分別檢測(cè)RACK1基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的水平。6.細(xì)胞增殖和毒性實(shí)驗(yàn)(CCK8實(shí)驗(yàn)):將轉(zhuǎn)染過shRACK1質(zhì)粒、shNC質(zhì)粒和過表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞種板至96孔板中。待細(xì)胞于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h貼壁后,分別給予不同濃度的順鉑(1-320umol/L)或5-氟尿嘧啶(1-10umol/L)培養(yǎng)48h或72h。每個(gè)孔內(nèi)加入10ul CCK8溶液,培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1-4h,每間隔1h使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm波長(zhǎng)處的光譜吸光度。根據(jù)0D值計(jì)算細(xì)胞活性。7.流氏細(xì)胞學(xué)分析:收集待檢測(cè)的食管癌細(xì)胞,用PBS溶液沖洗。室溫下加入PE和7ADD染色緩沖液維持15min。使用FACSAriaⅡ儀器檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,數(shù)據(jù)處理使用Flowjo軟件進(jìn)行。研究結(jié)果1.轉(zhuǎn)染食管鱗癌細(xì)胞系,上調(diào)或下調(diào)mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平:為了探討不同RACK1表達(dá)水平在食管鱗癌中發(fā)揮的作用,我們構(gòu)建了轉(zhuǎn)染細(xì)胞系:將攜帶shRACK1、shNC、RACK10RF的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Eca109、EC9706細(xì)胞中并篩選穩(wěn)定表達(dá)株。實(shí)時(shí)定量PCR法分別用于檢測(cè)轉(zhuǎn)染過表達(dá)、對(duì)照、shNC、shRACK1的Eca109、EC9706細(xì)胞中RACK1的mRNA水平。與對(duì)照組相比,過表達(dá)Eca109細(xì)胞中RACK1的mRNA水平上升至6.76±1.46(P=0.0209),過表達(dá)EC9706細(xì)胞中RACK1的mRNA水平上升至7.76±0.31(P=0.0007)。此外,轉(zhuǎn)染了 shRACK1的Eca109細(xì)胞中RACK1 的 mRNA 水平為 0.44±0.06(P=0.0037),轉(zhuǎn)染了 shRACK1 的 EC9706 細(xì)胞中RACK1的mRNA水平為0.33±0.07(P=0.0041)。RACK1的蛋白表達(dá)水平通過WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。在Eca109和EC9706過表達(dá)組,RACK1的蛋白表達(dá)水平明顯提高。與未轉(zhuǎn)染組相比,RACK1敲減組的蛋白水平顯著下降。2.上調(diào)或下調(diào)RACK1影響細(xì)胞的克隆形成能力:克隆形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,通過轉(zhuǎn)染shRACK1敲減RACK1基因后,細(xì)胞的克隆能力顯著下降(Eca109:254±11 vs 343±15,P=0.0013;EC9706:187±23 vs 353±7,P=0.0003,Figure 2a and b)。過表達(dá)RACK1組的克隆形成能力有了顯著提升(Eca109:393±14vs 343±15,P=0.0148;EC9706:369±12 vs 353±7,P=0.0280)。3.化療藥物作用下,RACK1增強(qiáng)Eca109和EC9706的增殖能力:CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:當(dāng)不同濃度的順鉑(0-320μM)和5-氟尿嘧啶(Eca109,0-10μM,EC9706,0-320μM)作用于 Eca109 和 EC9706 細(xì)胞 48h 或 72h 時(shí),RACK1 過表達(dá)組的食管鱗癌細(xì)胞的增殖能力明顯提高(P0.001),而RACK1敲減組食管鱗癌細(xì)胞的增殖能力明顯降低(P0.001)。4.RACK1調(diào)節(jié)食管癌化療耐藥:上調(diào)RACK1可以顯著抑制順鉑藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的發(fā)生,下調(diào)RACK1可以促進(jìn)細(xì)胞對(duì)順鉑藥物作用的敏感性(Eca109:P0.001 for shRACK1,P0.01 for shNC and P0.001 for over group;EC9706:P0.001 for shRACK1,P0.001 for shNC and P0.05 for over,respectively)。同樣地,5-氟尿嘧啶作用的細(xì)胞也出現(xiàn)類似的結(jié)果(Eca109:P0.001 for shRACK1,P0.01 for shNC,P0.05 for over;EC9706:P0.001 for shRACK1,P0.001 for shNC,P0.05 for over)。這些數(shù)據(jù)顯示 RACK1在調(diào)節(jié)食管癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的治療療效方面扮演重要角色。5.RACK1導(dǎo)致食管癌細(xì)胞發(fā)生化療耐藥的有關(guān)機(jī)制研究:為了探究RACK1影響食管鱗癌細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性不同的機(jī)制,我們檢測(cè)了敲減或過表達(dá)RACK1基因后細(xì)胞內(nèi)相關(guān)的因子AKT、Erk1/2、Bcl-2和Bim的變化。我們的研究結(jié)果顯示,AKT的磷酸化水平、抗凋亡蛋白Bc1-2的表達(dá)和促凋亡蛋白Bim的表達(dá)水平發(fā)生了顯著的變化。我們檢測(cè)了化療藥物對(duì)AKT、pAKT、ERK1/2、Bcl-2和Bim的影響。下調(diào)RACK1顯著抑制了 AKT和ERK1/2的活性,降低了 Bcl-2的表達(dá),促進(jìn)了 Bim蛋白的表達(dá)。相反地,上調(diào)RACK1促進(jìn)AKT和ERK1/2的激活,促進(jìn)了 Bcl-2的表達(dá),抑制了 Bim蛋白的表達(dá)。經(jīng)過24、48、72h的化療藥物作用之后,我們觀察到轉(zhuǎn)染了 shRACK1的細(xì)胞中pAKT和Bcl-2的表達(dá)明顯降低,而Bim蛋白的表達(dá)隨著順鉑和5-氟尿嘧啶藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)而逐步升高。結(jié)論RACK1可以激活PI3K/AKT通路,促進(jìn)AKT磷酸化的發(fā)生,并上調(diào)Bcl-2的表達(dá)水平,降低Bim的表達(dá)水平,繼而誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞化療耐藥的發(fā)生。降低RACK1的表達(dá),可以很大程度地增強(qiáng)食管癌的化療敏感性。第二部分RAGK1與食管鱗狀細(xì)胞癌放射敏感性的關(guān)系研究背景食管癌是世界上發(fā)病率和死亡率均較高的惡性腫瘤。根據(jù)最新流行病學(xué)調(diào)查研究顯示,中國(guó)食管癌的年發(fā)病人數(shù)可達(dá)477900,年死亡人數(shù)約為375000。在亞洲,最常見食管癌組織學(xué)類型為鱗狀細(xì)胞癌,而放射治療是其非常重要的治療方式之一。然而,由于腫瘤容易發(fā)生局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,放射抵抗成為導(dǎo)致放療失敗的重要因素。因此尋找新的影響放射敏感性的指標(biāo)并研發(fā)有效的放射增敏劑以改善放射治療策略,成為當(dāng)前一個(gè)亟待解決的問題�；罨牡鞍准っ窩受體1(RACK1)是一種活化的蛋白激酶C的結(jié)合蛋白質(zhì)。作為色氨酸-天冬氨酸蛋白家族中的一員,RACK1可以與多種蛋白質(zhì)結(jié)合并且參與許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的過程,例如PKC,JNK,Src,NF-kB等等。另外,RACK1在多種腫瘤的進(jìn)展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等過程中均發(fā)揮著不可替代的重要作用。我們前期研究表明RACK1與食管鱗癌的不良預(yù)后和腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)。目前,尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于RACK1和放射治療敏感性方面的報(bào)道。Bergami等人發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤中,上調(diào)RACK1的表達(dá)能夠減少紫外線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致輻射抵抗的發(fā)生。同時(shí),調(diào)節(jié)RACK1表達(dá)水平能夠改善黑色素瘤對(duì)放射治療的敏感性。RACK1與放射抵抗間可能存在著一定的聯(lián)系,但目前RACK1在放療領(lǐng)域的研究仍是空白。研究目的在本項(xiàng)課題中,我們旨在探討RACK1表達(dá)水平與食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞放射敏感性之間的關(guān)系,并對(duì)可能參與的通路、分子進(jìn)行初步的機(jī)制研究。研究方法1.細(xì)胞培養(yǎng):將Ecal09和EC9706細(xì)胞在補(bǔ)充有10%胎牛血清,100μg/ml鏈霉素和100U/ml青霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),每2-3天傳代。2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染:用脂質(zhì)體2000溶劑將載有shRNA或者shNC或者靶向RACK1基因開放閱讀框的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至Ecal09和EC9706細(xì)胞中。用400 ug/mL的G418培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)14天,并用300 ug/mL的G418培養(yǎng)液維持培養(yǎng),篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Ecal09和EC9706細(xì)胞株。RACK1的表達(dá)水平均通過實(shí)時(shí)PCR和免疫印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè),證實(shí)Ecal09和EC9706中RACK1過表達(dá)或敲減的效率。3.克隆形成實(shí)驗(yàn):將細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸浮液,并將其按照每孔約500個(gè)細(xì)胞接種至六孔板中。24h后待細(xì)胞貼壁,使用varian23EX醫(yī)學(xué)直線加速器照射實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞,單次照射劑量分別為0、2、4、6、8Gy。培養(yǎng)14天后,將細(xì)胞固定在無水乙醇中,用結(jié)晶紫染色半小時(shí),并計(jì)數(shù)形成的細(xì)胞集落(細(xì)胞數(shù)大于等于50個(gè))。附著率是指培養(yǎng)結(jié)束后某孔形成的細(xì)胞集落數(shù)量與該孔種植的細(xì)胞數(shù)量之比。存活分?jǐn)?shù)(Survival fraction,SF)是指每個(gè)劑量的附著率除以O(shè)Gy的附著率。集落形成能力是指在相同照射劑量下,實(shí)驗(yàn)組SF與對(duì)照組SF的比例。4.細(xì)胞增殖和毒性實(shí)驗(yàn)(CCK8實(shí)驗(yàn)):將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞分別種板至96孔板中并培養(yǎng)24小時(shí)。用單次劑量分別為0、2、4、6、8Gy射線處理轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組細(xì)胞并培養(yǎng)48小時(shí)。每孔加入10ul CCK8試劑和100ul培養(yǎng)基,然后孵育1小時(shí)。用自動(dòng)酶標(biāo)儀(BioRad)檢測(cè)450nm處細(xì)胞的光譜吸光度。根據(jù)0D值計(jì)算細(xì)胞活性,活細(xì)胞百分比=(0D轉(zhuǎn)染組-0D空白組)/(0D控制組-0D空白組)*100。5.流氏細(xì)胞學(xué)分析:將Ecal09和EC9706接種到6孔板中,24h后給予單劑量4Gy射線照射。細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后,收集細(xì)胞并將細(xì)胞與PE/7-ADD染色緩沖液在室溫下孵育15分鐘。使用BDFACSCalibur儀器檢測(cè)細(xì)胞凋亡。數(shù)據(jù)分析由Flowjo軟件進(jìn)行。PE膜聯(lián)蛋白V和7-AAD陰性細(xì)胞被認(rèn)為是存活的;PE膜聯(lián)蛋白V陽性和7-AAD陰性細(xì)胞作為早期凋亡細(xì)胞;PE膜聯(lián)蛋白V和7-AAD均陽性細(xì)胞對(duì)應(yīng)于晚期凋亡或已經(jīng)死亡的細(xì)胞。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)表示為平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差,使用雙尾Student’s t檢驗(yàn)和Oneway AN0VA進(jìn)行各組間學(xué)比較。使用GraphPad Prism 5.01版軟件,將多靶單擊模型擬合成劑量存活曲線。所有數(shù)據(jù)均重復(fù)了至少三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。P值0.05(*)或0.01(**)被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究結(jié)果1.轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞系,敲減或者過表達(dá)RACK1基因:我們分別使用RT-PCR和Western Blot來檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中RACK1在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。同shNC對(duì)照組相比,過表達(dá)RACK1的Ecal09細(xì)胞中RACK1的mRNA水平上升至3.76±0.31倍(P=0.0002),過表達(dá)RACK1的EC9706細(xì)胞中RACK1的mRNA水平上升至5.43±0.30倍(P0.0001);敲減RACK1的Ecal09細(xì)胞中RACK1的mRNA水平下調(diào)至0.44土0.06(P=0.0032),敲減RACK1的EC9706細(xì)胞中RACK1的mRNA水平下調(diào)至0.33±0.07(P=0.0056)。2.下調(diào)RACK1降低了照射后細(xì)胞的克隆形成能力,相反,上調(diào)RACK1促進(jìn)了照射后細(xì)胞的克隆形成能力:隨著單次照射劑量逐漸升高,同一細(xì)胞形成的克隆數(shù)逐漸減少。另外,在同等劑量作用下(2 Gy、4 Gy、6 Gy、8Gy),shRACKl組形成的克隆數(shù)明顯少于shNC組,過表達(dá)RACK1組的克隆數(shù)較shNC組升高。在Ecal09和EC9706兩種細(xì)胞系中得到了類似的結(jié)果。結(jié)果顯示下調(diào)RACK1可以降低放射線照射后的細(xì)胞克隆能力,而上調(diào)RACK1可以促進(jìn)照射后的細(xì)胞克隆能力。3.為了檢測(cè)放療對(duì)細(xì)胞的存活能力的影響,我們構(gòu)建了多靶點(diǎn)單擊模型,進(jìn)而擬合了劑量存活曲線。SF(存活分?jǐn)?shù))=1-(l-e-kD)n。SER(增敏比)=(shNC組Dq)/(shRACKl或over-RACKl組Dq)。我們計(jì)算了放射敏感性相關(guān)的參數(shù)k,n,DD,Dq,D37,SF和SER。我們發(fā)現(xiàn)敲減RACK1可以提高Ecal09和EC9706細(xì)胞的SER,而過表達(dá)RACK1降低了ESCC細(xì)胞的SER。4.敲低RACK1減少ESCC細(xì)胞在放射作用下的增殖能力;而過表達(dá)RACK1可以促進(jìn)射線作用下的細(xì)胞增殖能力:使用單次劑量為OGy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy的射線分別照射食管癌細(xì)胞并培養(yǎng)48h。CCK-8實(shí)驗(yàn)的生存曲線結(jié)果顯示:在單次為2Gy、4Gy、6Gy、8Gy的射線作用下,過表達(dá)RACK1組的存活細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組,敲減RACK1組的細(xì)胞存活率低于對(duì)照組(P0.001)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示RACK1可以促進(jìn)ESCC細(xì)胞的放射抵抗性,RACK1過表達(dá)可以降低ESCC對(duì)放射線作用的敏感性。5.RACK1過表達(dá)可以減少凋亡細(xì)胞的數(shù)量,促進(jìn)ESCC細(xì)胞對(duì)放射治療的抵抗性:我們進(jìn)行PE Annexin-V 7-AAD檢測(cè),對(duì)4Gy射線預(yù)處理和48小時(shí)孵育的ESCC細(xì)胞進(jìn)行了流式細(xì)胞術(shù)分析。單次4Gy照射后,過表達(dá)RACK1組的凋亡細(xì)胞百分比相對(duì)于對(duì)照組而言顯著降低(Ecal09:過表達(dá)組23.49%±1.56%vs對(duì)照組31.08%±1.23%,P=0.0187;EC9706:過表達(dá)組17.21%±1.15%vs對(duì)照組26.14%±1.59%,P=0.0105)。與對(duì)照細(xì)胞相比,敲減RACK1顯著增加了ESCC細(xì)胞中放射相關(guān)的細(xì)胞凋亡率(Eca109:shRACK1組42.35%±1.04%vs對(duì)照組31.08%±1.23%,P=0.0022;EC9706:shRACKl組42.64%±2.91%vs對(duì)照組26.14%±1.59%,P=0.0076)。這些數(shù)據(jù)表明,RACK1對(duì)ESCC在放射線作用下的凋亡能力起調(diào)節(jié)作用。6.敲減RACK1抑制了pAKT和Bcl-2的表達(dá),促進(jìn)Bim的表達(dá):我們通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了單次劑量4Gy照射下,細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。與對(duì)照組相比,下調(diào)RACK1可以減弱AKT磷酸化水平,降低pAKT和Bcl-2的表達(dá),同時(shí)Bim表達(dá)提高。相反地,過表達(dá)RACK1激活了AKT的活性,促進(jìn)pAKT的表達(dá),上調(diào)Bcl-2水平,降低了Bim水平。Ecal09和EC9706兩種細(xì)胞系均表現(xiàn)了類似的結(jié)果。結(jié)論RACK1與食管癌放射敏感性之間有著密切的聯(lián)系,高表達(dá)RACK1可以促進(jìn)腫瘤放射抵抗的發(fā)生,而敲減RACK1則會(huì)提高腫瘤細(xì)胞對(duì)放射線作用的敏感性。RACK1可以激活PI3K/AKT通路,促進(jìn)AKT磷酸化的發(fā)生,上調(diào)Bcl-2的表達(dá),下調(diào)Bim的表達(dá)�？傊�,本研究首次將RACK1與食管癌放射治療療效聯(lián)系起來,并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了研究,為改善食管癌放射敏感性提供了新方向。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.1
【圖文】：

圖１邋Ｅｃａｌ０９和ＥＣ９７０６細(xì)胞及細(xì)胞轉(zhuǎn)染后熒光顯示逡逑（ａ）普通顯微鏡下觀察到的Ｅｃａｌ０９細(xì)胞（ｂ）熒光顯微鏡下觀察到的轉(zhuǎn)染后逡逑Ｅｃａｌ０９細(xì)胞（ｃ）普通顯微鏡下觀察到的ＥＣ９７０６細(xì)胞（ｄ）熒光顯微鏡下觀察到逡逑的轉(zhuǎn)染后ＥＣ９７０６細(xì)胞逡逑

圖２食管淲癌細(xì)胞系Ｅｃａｌ０９和ＥＣ９７０６中ＲＡＣＫ１基因敲減或過表達(dá)逡逑（ａ）通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ＲＡＣＫ１基因在Ｅｃａｌ０９和ＫＣ９７０６細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率。逡逑與對(duì)照組相比，過表達(dá)組ＲＡＣＫ１基因的表達(dá)水平明顯升高，而敲減組ＲＡＣＫ１基因逡逑的表達(dá)水平明顯降低。內(nèi)參基因自－ａｃｔｉｎ作為參照條帶進(jìn)行對(duì)照。（ｂ）邋Ｅｃａｌ０９逡逑

圖３邋ＲＡＣＫｌ表達(dá)水平可以影響食管鱗癌細(xì)胞的克隆形成能力逡逑（ａ）上層３個(gè)圖分別是過表達(dá)ＲＡＣＫ１的Ｅｃａｌ０９細(xì)胞、正常Ｅｃａｌ０９細(xì)胞、敲減ＲＡＣＫ１逡逑的Ｅｃａｌ０９細(xì)胞的克隆形成能力的結(jié)果。下層３個(gè)圖分別是過表達(dá)ＲＡＣＫ１的ＥＣ９７０６逡逑細(xì)胞、正常ＥＣ９７０６細(xì)胞、敲減ＲＡＣＫ１的ＥＣ９７０６細(xì)胞的克隆形成能力的結(jié)果。（ｂ）逡逑

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Jian-Lin Wang;Jing-Ping Yu;Zhi-Qiang Sun;Su-Ping Sun;;Radiobiological characteristics of cancer stem cells from esophageal cancer cell lines[J];World Journal of Gastroenterology;2014年48期

本文編號(hào)：2794220