【摘要】：第一部分RACK1與食管鱗狀細胞癌化療耐藥的關系及相關機制的初步探討背景食管癌是全球最常見和最難治的惡性腫瘤之一。食管惡性腫瘤組織學類型以上皮來源的最為多見,常見病理類型為腺癌和鱗癌兩種,其中以鱗癌更為常見。我國食管癌中鱗癌占90%以上,腺癌占7%,其他病理類型少見。近幾十年來,隨著外科手術技術的逐步提高,新輔助治療手段的日益改進,靶向藥物的不斷研發(fā),免疫治療的臨床轉(zhuǎn)化,食管癌總體治療療效水平有了顯著的改善。大多數(shù)的食管癌患者確診時處于進展期或者晚期,只能接受化療、放療、免疫治療、輔助治療等。只有對化學治療藥物敏感的患者才能從化療中獲益,而化療耐藥的發(fā)生嚴重影響了治療療效。所以,尋找影響食管癌化療藥物敏感度的指標及其在化療耐藥中的潛在機制勢在必行。1989年,RACK1首次從雞基因組DNA集群和人類B淋巴母細胞系cDNA文庫中克隆出,它與G蛋白的β亞基具有高度的同源性。RACK1是色氨酸-天冬氨酸重復蛋白家族中的一員,采用了高度保守的七層折疊的β螺旋槳結構。作為錨定蛋白,RACK1可以與多種蛋白激酶或膜結合受體結合,運輸結合蛋白,調(diào)節(jié)結合蛋白的活性,參與轉(zhuǎn)錄翻譯的過程。RACK1基因在細胞生長、分裂、分化等多種生理活動和細胞侵襲、轉(zhuǎn)移等病理過程中均扮演著不可或缺的角色。研究表明,在非小細胞肺癌、乳腺癌、肝細胞肝癌、結直腸癌等多種癌癥中,與周圍正常組織相比,RACK1呈現(xiàn)了差異性表達。我們之前的研究證實,RACK1與食管鱗癌的預后相關,并能促進腫瘤的進展和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生。研究表明,RACK1可以調(diào)節(jié)部分凋亡相關基因和藥物敏感性相關基因,并與腫瘤的化療敏感性相關。另外,近期研究發(fā)現(xiàn),腫瘤中RACK1的表達水平與肝細胞肝癌的化療耐藥有一定的關系。研究目的本項研究旨在探討RACK1基因?qū)ca109、EC9706等食管鱗癌細胞系的克隆能力、增殖能力、凋亡能力及化療藥物作用的敏感性的影響,并進一步探究RACK1與食管鱗癌化療耐藥之間的潛在作用機制,為改善食管癌化療耐藥提供新的方向和思路。研究方法1.細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:在37℃恒溫、穩(wěn)定C02水平(含5%)的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)Eca109和EC9706,每隔2-3天進行傳代培養(yǎng)。將載有shRNA或者shNC或者靶向RACK1基因開放閱讀框的質(zhì)粒用脂質(zhì)體2000溶劑分別轉(zhuǎn)染至Eca109和EC9706細胞中。敲減或過表達的細胞需繼續(xù)培養(yǎng)48-72h,確定轉(zhuǎn)染效率并進行后續(xù)實驗。2.篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株:確定Eca109和EC9706細胞適宜的G418篩選濃度。使用G418藥物濃度為400ug/ml(篩選濃度)的培養(yǎng)液培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細胞14天,后續(xù)使用G418藥物濃度為300ug/ml(維持濃度)的培養(yǎng)液維持培養(yǎng),篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株。3.檢測轉(zhuǎn)染效率:轉(zhuǎn)染后的食管鱗癌細胞中RACK1表達水平通過實時PCR和免疫印跡實驗在RNA和蛋白質(zhì)兩個層次上進行檢測,證實Eca109和EC9706中RACK1過表達或敲減的效率。4.克隆形成實驗:培養(yǎng)瓶中的細胞被胰蛋白酶溶液消化成單細胞懸液,吹打均勻,每孔加入2ml細胞懸液,按照250個/ml的密度將細胞種板至六孔板內(nèi)。在37℃恒溫、5%C02的培養(yǎng)箱內(nèi)進行14天的培養(yǎng)后,加入無水乙醇固定10分鐘,后用濃度為0.1%的結晶紫染料染色30分鐘。計算形成克隆數(shù),包含50個細胞及以上的細胞集團可視為一個克隆�？寺⌒纬陕手傅氖寝D(zhuǎn)染細胞(敲減或過表達RACK1基因)形成的克隆數(shù)除以對照組細胞(未轉(zhuǎn)染)形成的克隆數(shù)。5.化療耐藥實驗:將轉(zhuǎn)染細胞和對照細胞按照1X 104個/孔密度種板至96孔板內(nèi),待細胞平鋪均勻,每孔加入不同濃度的順鉑(1-320umol/L)和5-氟尿嘧啶(1-10umol/L)培養(yǎng)48至72小時。CCK8實驗用來檢測細胞的活性。將細胞稀釋至5×104個/ml,均勻種板至六孔板中,恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h,加入化療藥物順鉑(1-320umol/L)或5-氟尿嘧啶(1-10umol/L)。細胞繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72小時后,用以分別檢測RACK1基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的水平。6.細胞增殖和毒性實驗(CCK8實驗):將轉(zhuǎn)染過shRACK1質(zhì)粒、shNC質(zhì)粒和過表達質(zhì)粒的細胞種板至96孔板中。待細胞于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h貼壁后,分別給予不同濃度的順鉑(1-320umol/L)或5-氟尿嘧啶(1-10umol/L)培養(yǎng)48h或72h。每個孔內(nèi)加入10ul CCK8溶液,培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1-4h,每間隔1h使用酶標儀檢測450nm波長處的光譜吸光度。根據(jù)0D值計算細胞活性。7.流氏細胞學分析:收集待檢測的食管癌細胞,用PBS溶液沖洗。室溫下加入PE和7ADD染色緩沖液維持15min。使用FACSAriaⅡ儀器檢測細胞凋亡率,數(shù)據(jù)處理使用Flowjo軟件進行。研究結果1.轉(zhuǎn)染食管鱗癌細胞系,上調(diào)或下調(diào)mRNA和蛋白質(zhì)表達水平:為了探討不同RACK1表達水平在食管鱗癌中發(fā)揮的作用,我們構建了轉(zhuǎn)染細胞系:將攜帶shRACK1、shNC、RACK10RF的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Eca109、EC9706細胞中并篩選穩(wěn)定表達株。實時定量PCR法分別用于檢測轉(zhuǎn)染過表達、對照、shNC、shRACK1的Eca109、EC9706細胞中RACK1的mRNA水平。與對照組相比,過表達Eca109細胞中RACK1的mRNA水平上升至6.76±1.46(P=0.0209),過表達EC9706細胞中RACK1的mRNA水平上升至7.76±0.31(P=0.0007)。此外,轉(zhuǎn)染了 shRACK1的Eca109細胞中RACK1 的 mRNA 水平為 0.44±0.06(P=0.0037),轉(zhuǎn)染了 shRACK1 的 EC9706 細胞中RACK1的mRNA水平為0.33±0.07(P=0.0041)。RACK1的蛋白表達水平通過WB實驗檢測。在Eca109和EC9706過表達組,RACK1的蛋白表達水平明顯提高。與未轉(zhuǎn)染組相比,RACK1敲減組的蛋白水平顯著下降。2.上調(diào)或下調(diào)RACK1影響細胞的克隆形成能力:克隆形成實驗的結果表明,通過轉(zhuǎn)染shRACK1敲減RACK1基因后,細胞的克隆能力顯著下降(Eca109:254±11 vs 343±15,P=0.0013;EC9706:187±23 vs 353±7,P=0.0003,Figure 2a and b)。過表達RACK1組的克隆形成能力有了顯著提升(Eca109:393±14vs 343±15,P=0.0148;EC9706:369±12 vs 353±7,P=0.0280)。3.化療藥物作用下,RACK1增強Eca109和EC9706的增殖能力:CCK-8實驗結果顯示:當不同濃度的順鉑(0-320μM)和5-氟尿嘧啶(Eca109,0-10μM,EC9706,0-320μM)作用于 Eca109 和 EC9706 細胞 48h 或 72h 時,RACK1 過表達組的食管鱗癌細胞的增殖能力明顯提高(P0.001),而RACK1敲減組食管鱗癌細胞的增殖能力明顯降低(P0.001)。4.RACK1調(diào)節(jié)食管癌化療耐藥:上調(diào)RACK1可以顯著抑制順鉑藥物誘導的細胞凋亡的發(fā)生,下調(diào)RACK1可以促進細胞對順鉑藥物作用的敏感性(Eca109:P0.001 for shRACK1,P0.01 for shNC and P0.001 for over group;EC9706:P0.001 for shRACK1,P0.001 for shNC and P0.05 for over,respectively)。同樣地,5-氟尿嘧啶作用的細胞也出現(xiàn)類似的結果(Eca109:P0.001 for shRACK1,P0.01 for shNC,P0.05 for over;EC9706:P0.001 for shRACK1,P0.001 for shNC,P0.05 for over)。這些數(shù)據(jù)顯示 RACK1在調(diào)節(jié)食管癌細胞對化療藥物的治療療效方面扮演重要角色。5.RACK1導致食管癌細胞發(fā)生化療耐藥的有關機制研究:為了探究RACK1影響食管鱗癌細胞對化療藥物敏感性不同的機制,我們檢測了敲減或過表達RACK1基因后細胞內(nèi)相關的因子AKT、Erk1/2、Bcl-2和Bim的變化。我們的研究結果顯示,AKT的磷酸化水平、抗凋亡蛋白Bc1-2的表達和促凋亡蛋白Bim的表達水平發(fā)生了顯著的變化。我們檢測了化療藥物對AKT、pAKT、ERK1/2、Bcl-2和Bim的影響。下調(diào)RACK1顯著抑制了 AKT和ERK1/2的活性,降低了 Bcl-2的表達,促進了 Bim蛋白的表達。相反地,上調(diào)RACK1促進AKT和ERK1/2的激活,促進了 Bcl-2的表達,抑制了 Bim蛋白的表達。經(jīng)過24、48、72h的化療藥物作用之后,我們觀察到轉(zhuǎn)染了 shRACK1的細胞中pAKT和Bcl-2的表達明顯降低,而Bim蛋白的表達隨著順鉑和5-氟尿嘧啶藥物作用時間的延長而逐步升高。結論RACK1可以激活PI3K/AKT通路,促進AKT磷酸化的發(fā)生,并上調(diào)Bcl-2的表達水平,降低Bim的表達水平,繼而誘導食管癌細胞化療耐藥的發(fā)生。降低RACK1的表達,可以很大程度地增強食管癌的化療敏感性。第二部分RAGK1與食管鱗狀細胞癌放射敏感性的關系研究背景食管癌是世界上發(fā)病率和死亡率均較高的惡性腫瘤。根據(jù)最新流行病學調(diào)查研究顯示,中國食管癌的年發(fā)病人數(shù)可達477900,年死亡人數(shù)約為375000。在亞洲,最常見食管癌組織學類型為鱗狀細胞癌,而放射治療是其非常重要的治療方式之一。然而,由于腫瘤容易發(fā)生局部復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移,放射抵抗成為導致放療失敗的重要因素。因此尋找新的影響放射敏感性的指標并研發(fā)有效的放射增敏劑以改善放射治療策略,成為當前一個亟待解決的問題�；罨牡鞍准っ窩受體1(RACK1)是一種活化的蛋白激酶C的結合蛋白質(zhì)。作為色氨酸-天冬氨酸蛋白家族中的一員,RACK1可以與多種蛋白質(zhì)結合并且參與許多信號轉(zhuǎn)導通路的過程,例如PKC,JNK,Src,NF-kB等等。另外,RACK1在多種腫瘤的進展、復發(fā)、轉(zhuǎn)移等過程中均發(fā)揮著不可替代的重要作用。我們前期研究表明RACK1與食管鱗癌的不良預后和腫瘤細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關。目前,尚未發(fā)現(xiàn)關于RACK1和放射治療敏感性方面的報道。Bergami等人發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤中,上調(diào)RACK1的表達能夠減少紫外線誘導的細胞凋亡,導致輻射抵抗的發(fā)生。同時,調(diào)節(jié)RACK1表達水平能夠改善黑色素瘤對放射治療的敏感性。RACK1與放射抵抗間可能存在著一定的聯(lián)系,但目前RACK1在放療領域的研究仍是空白。研究目的在本項課題中,我們旨在探討RACK1表達水平與食管鱗狀細胞癌細胞放射敏感性之間的關系,并對可能參與的通路、分子進行初步的機制研究。研究方法1.細胞培養(yǎng):將Ecal09和EC9706細胞在補充有10%胎牛血清,100μg/ml鏈霉素和100U/ml青霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),每2-3天傳代。2.細胞轉(zhuǎn)染:用脂質(zhì)體2000溶劑將載有shRNA或者shNC或者靶向RACK1基因開放閱讀框的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至Ecal09和EC9706細胞中。用400 ug/mL的G418培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)14天,并用300 ug/mL的G418培養(yǎng)液維持培養(yǎng),篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Ecal09和EC9706細胞株。RACK1的表達水平均通過實時PCR和免疫印跡實驗進行檢測,證實Ecal09和EC9706中RACK1過表達或敲減的效率。3.克隆形成實驗:將細胞消化成單細胞懸浮液,并將其按照每孔約500個細胞接種至六孔板中。24h后待細胞貼壁,使用varian23EX醫(yī)學直線加速器照射實驗組與對照組細胞,單次照射劑量分別為0、2、4、6、8Gy。培養(yǎng)14天后,將細胞固定在無水乙醇中,用結晶紫染色半小時,并計數(shù)形成的細胞集落(細胞數(shù)大于等于50個)。附著率是指培養(yǎng)結束后某孔形成的細胞集落數(shù)量與該孔種植的細胞數(shù)量之比。存活分數(shù)(Survival fraction,SF)是指每個劑量的附著率除以OGy的附著率。集落形成能力是指在相同照射劑量下,實驗組SF與對照組SF的比例。4.細胞增殖和毒性實驗(CCK8實驗):將實驗組和對照組細胞分別種板至96孔板中并培養(yǎng)24小時。用單次劑量分別為0、2、4、6、8Gy射線處理轉(zhuǎn)染組和對照組細胞并培養(yǎng)48小時。每孔加入10ul CCK8試劑和100ul培養(yǎng)基,然后孵育1小時。用自動酶標儀(BioRad)檢測450nm處細胞的光譜吸光度。根據(jù)0D值計算細胞活性,活細胞百分比=(0D轉(zhuǎn)染組-0D空白組)/(0D控制組-0D空白組)*100。5.流氏細胞學分析:將Ecal09和EC9706接種到6孔板中,24h后給予單劑量4Gy射線照射。細胞培養(yǎng)24小時后,收集細胞并將細胞與PE/7-ADD染色緩沖液在室溫下孵育15分鐘。使用BDFACSCalibur儀器檢測細胞凋亡。數(shù)據(jù)分析由Flowjo軟件進行。PE膜聯(lián)蛋白V和7-AAD陰性細胞被認為是存活的;PE膜聯(lián)蛋白V陽性和7-AAD陰性細胞作為早期凋亡細胞;PE膜聯(lián)蛋白V和7-AAD均陽性細胞對應于晚期凋亡或已經(jīng)死亡的細胞。6.統(tǒng)計學分析:使用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)表示為平均值土標準誤差,使用雙尾Student’s t檢驗和Oneway AN0VA進行各組間學比較。使用GraphPad Prism 5.01版軟件,將多靶單擊模型擬合成劑量存活曲線。所有數(shù)據(jù)均重復了至少三次獨立實驗。P值0.05(*)或0.01(**)被認為有統(tǒng)計學差異。研究結果1.轉(zhuǎn)染食管癌細胞系,敲減或者過表達RACK1基因:我們分別使用RT-PCR和Western Blot來檢測轉(zhuǎn)染細胞中RACK1在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達。同shNC對照組相比,過表達RACK1的Ecal09細胞中RACK1的mRNA水平上升至3.76±0.31倍(P=0.0002),過表達RACK1的EC9706細胞中RACK1的mRNA水平上升至5.43±0.30倍(P0.0001);敲減RACK1的Ecal09細胞中RACK1的mRNA水平下調(diào)至0.44土0.06(P=0.0032),敲減RACK1的EC9706細胞中RACK1的mRNA水平下調(diào)至0.33±0.07(P=0.0056)。2.下調(diào)RACK1降低了照射后細胞的克隆形成能力,相反,上調(diào)RACK1促進了照射后細胞的克隆形成能力:隨著單次照射劑量逐漸升高,同一細胞形成的克隆數(shù)逐漸減少。另外,在同等劑量作用下(2 Gy、4 Gy、6 Gy、8Gy),shRACKl組形成的克隆數(shù)明顯少于shNC組,過表達RACK1組的克隆數(shù)較shNC組升高。在Ecal09和EC9706兩種細胞系中得到了類似的結果。結果顯示下調(diào)RACK1可以降低放射線照射后的細胞克隆能力,而上調(diào)RACK1可以促進照射后的細胞克隆能力。3.為了檢測放療對細胞的存活能力的影響,我們構建了多靶點單擊模型,進而擬合了劑量存活曲線。SF(存活分數(shù))=1-(l-e-kD)n。SER(增敏比)=(shNC組Dq)/(shRACKl或over-RACKl組Dq)。我們計算了放射敏感性相關的參數(shù)k,n,DD,Dq,D37,SF和SER。我們發(fā)現(xiàn)敲減RACK1可以提高Ecal09和EC9706細胞的SER,而過表達RACK1降低了ESCC細胞的SER。4.敲低RACK1減少ESCC細胞在放射作用下的增殖能力;而過表達RACK1可以促進射線作用下的細胞增殖能力:使用單次劑量為OGy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy的射線分別照射食管癌細胞并培養(yǎng)48h。CCK-8實驗的生存曲線結果顯示:在單次為2Gy、4Gy、6Gy、8Gy的射線作用下,過表達RACK1組的存活細胞比例明顯高于對照組,敲減RACK1組的細胞存活率低于對照組(P0.001)。實驗結果表示RACK1可以促進ESCC細胞的放射抵抗性,RACK1過表達可以降低ESCC對放射線作用的敏感性。5.RACK1過表達可以減少凋亡細胞的數(shù)量,促進ESCC細胞對放射治療的抵抗性:我們進行PE Annexin-V 7-AAD檢測,對4Gy射線預處理和48小時孵育的ESCC細胞進行了流式細胞術分析。單次4Gy照射后,過表達RACK1組的凋亡細胞百分比相對于對照組而言顯著降低(Ecal09:過表達組23.49%±1.56%vs對照組31.08%±1.23%,P=0.0187;EC9706:過表達組17.21%±1.15%vs對照組26.14%±1.59%,P=0.0105)。與對照細胞相比,敲減RACK1顯著增加了ESCC細胞中放射相關的細胞凋亡率(Eca109:shRACK1組42.35%±1.04%vs對照組31.08%±1.23%,P=0.0022;EC9706:shRACKl組42.64%±2.91%vs對照組26.14%±1.59%,P=0.0076)。這些數(shù)據(jù)表明,RACK1對ESCC在放射線作用下的凋亡能力起調(diào)節(jié)作用。6.敲減RACK1抑制了pAKT和Bcl-2的表達,促進Bim的表達:我們通過免疫印跡實驗檢測了單次劑量4Gy照射下,細胞凋亡相關蛋白的表達水平。與對照組相比,下調(diào)RACK1可以減弱AKT磷酸化水平,降低pAKT和Bcl-2的表達,同時Bim表達提高。相反地,過表達RACK1激活了AKT的活性,促進pAKT的表達,上調(diào)Bcl-2水平,降低了Bim水平。Ecal09和EC9706兩種細胞系均表現(xiàn)了類似的結果。結論RACK1與食管癌放射敏感性之間有著密切的聯(lián)系,高表達RACK1可以促進腫瘤放射抵抗的發(fā)生,而敲減RACK1則會提高腫瘤細胞對放射線作用的敏感性。RACK1可以激活PI3K/AKT通路,促進AKT磷酸化的發(fā)生,上調(diào)Bcl-2的表達,下調(diào)Bim的表達。總之,本研究首次將RACK1與食管癌放射治療療效聯(lián)系起來,并對其作用機制進行了研究,為改善食管癌放射敏感性提供了新方向。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.1
【圖文】：

圖１邋Ｅｃａｌ０９和ＥＣ９７０６細胞及細胞轉(zhuǎn)染后熒光顯示逡逑（ａ）普通顯微鏡下觀察到的Ｅｃａｌ０９細胞（ｂ）熒光顯微鏡下觀察到的轉(zhuǎn)染后逡逑Ｅｃａｌ０９細胞（ｃ）普通顯微鏡下觀察到的ＥＣ９７０６細胞（ｄ）熒光顯微鏡下觀察到逡逑的轉(zhuǎn)染后ＥＣ９７０６細胞逡逑

圖２食管淲癌細胞系Ｅｃａｌ０９和ＥＣ９７０６中ＲＡＣＫ１基因敲減或過表達逡逑（ａ）通過免疫印跡實驗驗證ＲＡＣＫ１基因在Ｅｃａｌ０９和ＫＣ９７０６細胞中的轉(zhuǎn)染效率。逡逑與對照組相比，過表達組ＲＡＣＫ１基因的表達水平明顯升高，而敲減組ＲＡＣＫ１基因逡逑的表達水平明顯降低。內(nèi)參基因自－ａｃｔｉｎ作為參照條帶進行對照。（ｂ）邋Ｅｃａｌ０９逡逑

圖３邋ＲＡＣＫｌ表達水平可以影響食管鱗癌細胞的克隆形成能力逡逑（ａ）上層３個圖分別是過表達ＲＡＣＫ１的Ｅｃａｌ０９細胞、正常Ｅｃａｌ０９細胞、敲減ＲＡＣＫ１逡逑的Ｅｃａｌ０９細胞的克隆形成能力的結果。下層３個圖分別是過表達ＲＡＣＫ１的ＥＣ９７０６逡逑細胞、正常ＥＣ９７０６細胞、敲減ＲＡＣＫ１的ＥＣ９７０６細胞的克隆形成能力的結果。（ｂ）逡逑

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 Jian-Lin Wang;Jing-Ping Yu;Zhi-Qiang Sun;Su-Ping Sun;;Radiobiological characteristics of cancer stem cells from esophageal cancer cell lines[J];World Journal of Gastroenterology;2014年48期

本文編號：2794220