【摘要】：研究背景和目的急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是最常見的造血系統(tǒng)腫瘤,增殖缺陷和分化受阻是導(dǎo)致白血病干細(xì)胞能過度增殖的兩大原因。至今為止,大部分AML患者的治療現(xiàn)狀也不容樂觀,即使能夠通過化療使病情完全緩解,復(fù)發(fā)的比率也仍然不容樂觀。雖然ATRA用于誘導(dǎo)分化治療AML取得了成功,但是ATRA誘導(dǎo)分化治療僅對占AML 10%的APL(M3型AML)有效,而且還存在維甲酸綜合征和維甲酸耐藥兩大缺陷,因此研究新的誘導(dǎo)分化劑也已經(jīng)成為治療AML研究的迫切需要。酪氨酸激酶(protein tyrosine kinases,PTK)的異常激活在AML發(fā)病進(jìn)程中發(fā)揮重要作用,以PTK為靶點的藥物研發(fā)和治療方案已成為研究熱點,許多酪氨酸蛋白激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor,TKI)類抗腫瘤藥物被報道具有脫靶效應(yīng)(off-target),具有一定的白血病治療作用。然而這些藥物自身誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化活性較弱,但是能協(xié)同ATRA誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化。Vibsane型二萜化合物是莢醚屬植物內(nèi)提取的天然小分子化合物,存在80多種構(gòu)型,具有魚毒活性,被廣泛報道具有抗腫瘤作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)Vibsanin A是一種新型的誘導(dǎo)分化劑,能顯著誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化,隨后發(fā)現(xiàn)并確證了蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)是其誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化的作用靶點,Vibsanin A通過激活PKC依賴的ERK/MAPK途徑誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化,研究還發(fā)現(xiàn)Vibsanin A能夠協(xié)同酪氨酸激酶抑制劑誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化,本課題擬通過細(xì)胞分化模型篩選,發(fā)現(xiàn)酪氨酸激酶抑制劑協(xié)同Vibsanin A誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化的最佳組合;深入研究PTK和PKC及其介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,以期揭示酪氨酸激酶抑制聯(lián)合Vibsanin A誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化的分子機制,最終為誘導(dǎo)分化治療AML提供新的治療方案和藥物靶點。研究方法1.利用流式細(xì)胞學(xué)檢測細(xì)胞表面分化抗原CD11b的方法,篩選出一類可能具有誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化作用的TKIs,并分別評估這些化合物聯(lián)合Vibsanin A協(xié)同誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化的活性。2.通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)實驗、細(xì)胞增殖抑制實驗和細(xì)胞周期實驗和周期蛋白檢測進(jìn)一步確定酪氨酸激酶抑制劑聯(lián)合Vibsanin A誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化的協(xié)同作用。3.利用經(jīng)典PKC激動劑作為陽性對照藥物,利用PKC信號分子抑制劑干預(yù)AML細(xì)胞分化,如GFX(PKC非選擇性抑制劑)及GO6983(傳統(tǒng)型和新型PKC抑制劑,抑制PKC-γ、ε、η、θ)等,觀察它們對酪氨酸激酶靶向抗腫瘤藥物聯(lián)合FTC誘導(dǎo)的白血病細(xì)胞分化的作用,驗證PKC途徑是否參與協(xié)同誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化。4.本部分研究重點以PKC下游與白血病細(xì)胞分化相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路如MAPK為主要研究對象,采用Western blot、免疫共沉淀等技術(shù),觀察通路中關(guān)鍵性信號分子磷酸化水平變化的時空效應(yīng),確定參與誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化的PKC下游信號分子,并分析PKC與酪氨酸激酶調(diào)控的相互作用關(guān)系(協(xié)同或拮抗關(guān)鍵信號分子的激活效應(yīng))。5.靶向沉默或過表達(dá)技術(shù)對協(xié)同誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化的關(guān)鍵信號分子進(jìn)行驗證。研究結(jié)果1.Vibsanin A聯(lián)合TKIs誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化。通過細(xì)胞表面分化抗原流式細(xì)胞學(xué)檢測,我們發(fā)現(xiàn)一系列FDA批準(zhǔn)于上市的TKIs在沒有明顯毒性的劑量下都能誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化,大部分TKIs都能協(xié)同Vibsanin A誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化,其中Imatinib和Sracatinib與Vibsanin A的協(xié)同作用最強。2.Vibsanin A能聯(lián)合TKIs誘導(dǎo)AML細(xì)胞生長抑制和周期阻滯。Vibsanin A聯(lián)合TKIs能夠誘導(dǎo)AML細(xì)胞G1期細(xì)胞增加從而顯著協(xié)同抑制細(xì)胞增殖。蛋白水平研究結(jié)果表明Vibsanin A能顯著的聯(lián)合TKIs上調(diào)周期蛋白P21和P27的表達(dá),降低CDK4和CDK6的表達(dá),并且抑制Rb蛋白的磷酸化。3.Vibsanin A聯(lián)合TKIs通過PKC途徑的激活誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化。經(jīng)典的PKC激動劑PMA與Vibsanin A有相似的協(xié)同TKIs誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化的作用,廣譜PKC抑制劑能夠部分抑制TKIs聯(lián)合Vibsanin A或TKIs單獨誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化。4.Vibsanin A聯(lián)合TKIs上調(diào)Lyn蛋白的表達(dá),從而誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化。Y416位點是SRC家族激酶通用的磷酸化位點,研究結(jié)果表明Vibsanin A能增強SRC家族激酶Y416位點磷酸化,而TKIs則抑制該位點的磷酸化,但是TKIs單獨均能均誘導(dǎo)SRC蛋白激酶家族中Lyn蛋白表達(dá)增加,并且與Vibsanin A上調(diào)Lyn蛋白表達(dá)的作用存在正向協(xié)同。對Lyn進(jìn)行免疫沉淀后,發(fā)現(xiàn)Lyn的Y416位點磷酸化水平與其總蛋白的表達(dá)水平無關(guān),為驗證Lyn蛋白的上調(diào)在誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化中的關(guān)鍵作用,我們構(gòu)建了靶向沉默Lyn的慢病毒,發(fā)現(xiàn)靶向干擾Lyn能夠抑制所有TKIs聯(lián)合Vibsanin A誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化的作用,在靶向干擾Lyn的同時抑制PKC途徑則幾乎完全阻斷AML細(xì)胞分化。5.PKC和Lyn通過Raf/MEK/ERK信號通路聯(lián)合誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化。Vibsanin A能聯(lián)合TKIs能增強ERK1/2、MEK、以及Raf-1的S338和S289/296/301位點的磷酸化的作用,并進(jìn)一步抑制Raf活性抑制位點S259的磷酸化。Raf-1抑制劑Sorafenib和ERK1/2抑制劑U0126均能抑制聯(lián)合誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化,抑制PKC途徑或者靶向沉默Lyn均能抑制Raf/MEK/ERK信號通路的激活。6.Vibsanin A聯(lián)合TKIs下調(diào)c-Myc蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化。Vibsanin A聯(lián)合TKIs用藥后1h,實時熒光定量和Western blot檢測到c-Myc蛋白在轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào)和蛋白水平的降解,Raf-1抑制劑Sorafenib和ERK1/2抑制劑U0126能夠減弱Vibsanin A聯(lián)合TKIs誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞內(nèi)c-Myc蛋白下調(diào)的作用,阻斷PKC途徑和靶向沉默Lyn也能逆轉(zhuǎn)c-Myc蛋白的表達(dá),最后,我們建立過表達(dá)c-Myc的AML細(xì)胞株,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)c-Myc能拮抗TKIs聯(lián)合Vibsanin A誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化的作用。研究結(jié)論1.研究發(fā)現(xiàn)天然小分子化合物Vibsanin A能夠增強TKIs誘導(dǎo)AML分化的作用。2.Vibsanin A聯(lián)合TKIs通過PKC途徑和Lyn途徑發(fā)揮協(xié)同誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化的作用。3.Vibsanin A聯(lián)合TKIs通過激活PKC和上調(diào)Lyn蛋白表達(dá)協(xié)同激活ERK/MAPK信號通路,增強對c-Myc的抑制作用,從而上調(diào)周期蛋白的表達(dá)使AML細(xì)胞周期阻滯,并協(xié)誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化。4.Vibsanin A聯(lián)合TKIs有望為AML或其他白血病治療提供新的誘導(dǎo)分化治療策略。
【學(xué)位授予單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R733.7
【圖文】：

第一章 天然小分子化合物 Vibsanin A 聯(lián)合酪氨酸激酶抑制劑誘導(dǎo)AML 細(xì)胞分化效應(yīng)研究本課題前期研究在國家“重大新藥創(chuàng)制”專項課題《天然活性成分 Vibsanin A靶向 PKC 誘導(dǎo)分化治療白血病的候選藥物研究》（課題編號：2009ZX09103-406；2009-2010）資助下從早禾樹樹葉中提取了大量的天然 Vibsanin 型二萜化合物，發(fā)現(xiàn)其中 Vibsanin A 是一個具有潛力的誘導(dǎo)分化劑(如下圖所示)，能夠誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化、抑制白血病細(xì)胞增殖，進(jìn)而降低白血病細(xì)胞的成瘤性，發(fā)現(xiàn)并確證了蛋白激酶 C（PKC）是其誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化的作用靶點，分子機制研究結(jié)果揭示PKC/ERK通路參與Vibsanin A誘導(dǎo)的白血病細(xì)胞分化，表明小分子化合物VibsaninA 是一個有前景的靶向 PKC 誘導(dǎo)分化治療白血病的候選藥物。

圖 1.2 TKIs 誘導(dǎo) HL-60 細(xì)胞分化活性篩選Imatinb(IMA)與 Saracatinib(SAR) (5、10、20μM)； Bosutinib(BOSU)（1.25、2.5、5 μM）；Dasatinib(DASA) 、Gefitinib(GEFI)、Erlotinib(ERLO)與 Nilotinib(NILO)（2.5、5、10μM）聯(lián)合誘導(dǎo) HL-60 細(xì)胞 72h 后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測 CD11b 的表達(dá)。圖中數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，n=3，各劑量藥物處理組與 DMSO 對照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，Student t檢驗分析數(shù)據(jù)顯著性差異。1.3.2 TKIs 協(xié)同 Vibsanin A 誘導(dǎo) HL-60 細(xì)胞分化活性篩選天然小分子化合物 Vibsanin A0.1μM 劑量單獨誘導(dǎo) HL-60 細(xì)胞 CD11b 表面標(biāo)記的表達(dá)率為 13.3±1.9%，故采用該劑量（0.1μM）用于聯(lián)合酪氨酸激酶抑制劑誘導(dǎo) AML 細(xì)胞分化研究（圖 1.3A）。流式細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果表明（圖 1.3B）：大部分酪氨酸激酶抑制劑均能聯(lián)合低劑量 Vibsanin A 顯著增強誘導(dǎo)急性髓系白血病細(xì)胞HL-60 的分化效應(yīng)，其中 Saracatinib、Imatinib10μM 劑量下聯(lián)合 Vibsanin A0.1μM誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞CD11b表達(dá)率分別從21.9%和29.5%提升至75.1%和87.3%；EGFR抑制劑 Erlotinib、Gefitinib 單獨幾乎不誘導(dǎo) HL-60 細(xì)胞 CD11b 表達(dá)，聯(lián)合 VibsaninA 卻可將 CD11b 的表達(dá)率分別從 2.99%和 2.29%提高至 52.6 和 56.7%；Dasatinib

Dasatinib（5μM）和 Nilotinib（10μM）聯(lián)合 Vibsanin A (0.1 μM)誘導(dǎo) HL-60 細(xì)胞分化 3d 后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測 CD11b 的表達(dá)（B）。綜合評估各抑制劑增強 Vibsanin A 誘導(dǎo) AML 細(xì)胞分化能力（C），圖中數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，n=3， *P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 與對DMSO 對照組相比（Student t 檢驗）；## P < 0.01, ### P < 0.001 表示協(xié)同用藥組與兩個單獨用藥組相比同時具有統(tǒng)計學(xué)差異（one-way ANOVA），& P < 0.05 與 Vibsanin A 組相比（Studentt 檢驗）。1.3.3 Vibsanin A 協(xié)同 TKIs 誘導(dǎo) HL-60 細(xì)胞分化的量效關(guān)系梯 度 濃 度 （ Imatinib 或 Saracatinib 聯(lián) 合 相 應(yīng) 固 定 劑 量 比 的 Vibsanin A（Imatinib/Saracatinib: VibsaninA=100：1）處理 HL-60 細(xì)胞 72h，經(jīng)流式細(xì)胞學(xué)檢測 CD11b 表達(dá)，并根據(jù) Chou-Talalay 聯(lián)合指數(shù)法[32]，計算藥物聯(lián)用的 CI 值。結(jié)果表明 Imatinib（圖 1.4A、B）或 Saracatinib（圖 1.4C、D）聯(lián)合 VibsaninA 誘導(dǎo) HL-60細(xì)胞 CD11b 表達(dá)的 CI 值均小于 1，具有顯著的正向協(xié)同誘導(dǎo) AML 細(xì)胞分化的作用，當(dāng) Imatinib 或 Saracatinib 用藥劑量為 10μM，聯(lián)合 VibsaninA0.1μM 的情況下，CI 值均小于 0.01（分別為 0.009 和 0.002），表明在該劑量下，Imatinib 或 Saracatinib與 VibsaninA 具有極強的協(xié)同誘導(dǎo)分化作用。A B

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