【摘要】：肝癌(liver cancer,LC)的年死亡率在惡性腫瘤中居第二、發(fā)病率居全球第五位,2012年約有782,500個新增肝癌病例和745,500肝癌死亡病例,這些病例中約有50%來自于中國(1,2)。原發(fā)性肝癌的臨床特點為隱匿性起病、進展非常迅速、預(yù)后極其差,嚴(yán)重威脅我國及世界人民的身體健康。因此積極尋找新的治療方向是目前我國乃至全球肝癌診治中的重要任務(wù)。近期研究發(fā)現(xiàn)β腎上腺素能受體(β-adrenegic receptor,β-AR)信號通路與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān),尤其以β2腎上腺素能受體信號通路為主,參與了腫瘤發(fā)生和發(fā)展的多個過程,包括炎癥、血管生成、細胞凋亡及失巢凋亡、細胞免疫應(yīng)答、細胞的運動及細胞自噬等,與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展、腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(3)。β腎上腺素能受體信號通路也參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展過程。我國肝癌多是在肝硬化尤其是乙肝肝硬化基礎(chǔ)上發(fā)展而來,而肝硬化患者交感神經(jīng)系統(tǒng)活性升高、去甲腎上腺素及腎上腺素的含量明顯升高,存在兒茶酚胺代謝紊亂。非選擇性β受體阻滯劑(non-selective beta blocker,NSBB)可能作為抗肝硬化患者腫瘤生成藥物有獨到之處。肝臟炎癥促進腫瘤生成,非選擇性β受體阻滯劑減少細菌移位,因此減少來自于腸道的前炎癥細胞因子進入肝臟。非選擇性β受體阻滯劑抑制驅(qū)動腫瘤細胞的遷移、腫瘤血管生成、侵襲和增生的兒茶酚胺。非選擇性β受體阻滯劑是抗血管源性的,因此可以抑制肝癌生長。一項臨床meta分析也顯示非選擇性β受體阻滯劑減少肝硬化患者的死亡率,不僅僅是通過減少胃腸道出血率可以解釋的,一部分好處可能在于降低肝癌的發(fā)生率。鹽酸普萘洛爾(propranolol hydrochloride,PPL)是中國《肝硬化伴食管胃靜脈曲張破裂出血臨床指南》中推薦的降低門靜脈壓力、預(yù)防食管胃靜脈曲張破裂出血的一級預(yù)防用藥。鹽酸普萘洛爾除了傳統(tǒng)的治療高血壓、心律失常、缺血性心臟病等疾病外,近來研究發(fā)現(xiàn)普萘洛爾有抑制血管生成過程、誘導(dǎo)微血管內(nèi)皮細胞的凋亡等作用機制,對處于增殖期與消退期的嬰幼兒血管瘤均有顯著療效,已被國內(nèi)外指南推薦為嬰幼兒血管瘤治療的一線藥物(4)。40多年臨床實踐證實鹽酸普萘洛爾安全、耐受性好,因其對β-AR尤其是β2-AR的阻斷作用,在腫瘤的治療中應(yīng)有進一步的發(fā)展。本研究擬給予肝癌細胞不同濃度的鹽酸普萘洛爾,來觀察鹽酸普萘洛爾可否抑制肝癌細胞的細胞增殖。以正常人肝細胞株為對照來選擇鹽酸普萘洛爾最合適的用藥濃度:這個濃度可抑制肝癌細胞的增殖,同時不影響正常肝細胞的細胞增殖。同時,我們擬檢測是否肝癌細胞表面β受體較正常肝細胞的表達水平升高,以期確定鹽酸普萘洛爾通過是否通過對β受體信號通路的作用介導(dǎo)對肝癌細胞生長的調(diào)控。觀察鹽酸普萘洛爾對肝癌細胞的遷移和侵襲性是否有影響。接下來,我們將重點研究鹽酸普萘洛爾導(dǎo)致的肝癌細胞的死亡是否通過細胞凋亡或是細胞自噬實現(xiàn),并探討鹽酸普萘洛爾在細胞凋亡和細胞自噬中的作用機制。本研究可初步探討β受體信號通路在肝癌細胞增殖和死亡中的作用機制,并以正臨床廣泛應(yīng)用的藥物—鹽酸普萘洛爾為研究對象進行機制探討,可以為鹽酸普萘洛爾在臨床抗腫瘤治療方面提供基礎(chǔ)實驗依據(jù),為臨床藥物治療肝癌提供輔助治療的新思路,本研究內(nèi)容目前在國內(nèi)外鮮有報道。研究方法:1.通過免疫熒光檢測、Western Blot技術(shù)和q RT-PCR技術(shù)來觀察不同的肝癌細胞株表面的β受體分布情況;同時觀察給予不同濃度鹽酸普萘洛爾后肝癌細胞株β受體的改變,闡明鹽酸普萘洛爾是否通過β受體對肝癌細胞產(chǎn)生影響;2.通過Incu Cyte Zoom長時間動態(tài)成像及分析系統(tǒng)動態(tài)觀察給予不同濃度的鹽酸普萘洛爾后肝癌細胞及正常肝細胞的細胞增殖情況;流式細胞術(shù)檢測死亡細胞比例,使用鹽酸異丙腎上腺素研究體外阻斷β受體信號通路后對肝癌細胞增殖及存活能力的影響;3.通過特異性的β2受體抑制劑ICI 118,551和特異性的β2受體激動劑福莫特羅觀察其對肝癌細胞增殖情況,研究鹽酸普萘洛爾對于肝癌細胞增殖的抑制是否主要通過β2受體來實現(xiàn)。4.通過劃痕實驗,利用Incu Cyte Zoom長時間動態(tài)成像及分析系統(tǒng)觀察鹽酸普萘洛爾對于肝癌細胞遷移和細胞侵襲的影響。5.通過DAPI染色、Hoechst33342/PI染色技術(shù)觀察鹽酸普萘洛爾對肝癌細胞凋亡的形態(tài)學(xué)影響;利用流式細胞技術(shù)Annexin V/PI雙染定量檢測鹽酸普萘洛爾對肝癌細胞細胞凋亡數(shù)的影響;6.利用流式細胞術(shù)檢測鹽酸普萘洛爾對肝癌細胞周期的影響;7.利用免疫熒光JC-1檢測鹽酸普萘洛爾對凋亡細胞線粒體膜電勢的影響;利用Western Blot技術(shù)來研究鹽酸普萘洛爾阻斷β受體信號通路后對肝癌細胞凋亡的機制探討;8.通過ICI 118,551和福莫特羅觀察β2受體信號通路對鹽酸普萘洛爾誘導(dǎo)的肝癌細胞凋亡的影響;9.利用免疫熒光染色及Western Blot觀察鹽酸普萘洛爾對肝癌細胞自噬的誘導(dǎo);轉(zhuǎn)染stub RFP-sens GFP-LC3的慢病毒進入肝癌細胞,檢測鹽酸普萘洛爾在細胞自噬過程中自噬流的變化;10.通過ICI 118,551和福莫特羅觀察β2受體信號通路是否參與鹽酸普萘洛爾誘導(dǎo)的肝癌細胞自噬;11.利用Western Blot技術(shù)研究鹽酸普萘洛爾對細胞自噬相關(guān)蛋白的變化,探討可能的作用機制;12.利用凋亡抑制劑Z-VAD、自噬抑制劑3-MA、自噬激活劑雷帕霉素,通過Western Blot技術(shù)、免疫熒光技術(shù)等方法來探討鹽酸普萘洛爾誘導(dǎo)的肝癌細胞凋亡和細胞自噬之間的相互關(guān)系。結(jié)果1.肝癌細胞中β腎上腺素能受體表達升高,以β2受體為主,鹽酸普萘洛爾通過降低β腎上腺素能受體抑制肝癌細胞增殖。2.鹽酸普萘洛爾主要通過阻斷β2腎上腺素能受體發(fā)揮抑制肝癌細胞的增殖作用。3.鹽酸普萘洛爾可以抑制肝癌細胞遷移和侵襲。4.鹽酸普萘洛爾能夠誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡,主要通過阻斷β2腎上腺素能受體信號通路發(fā)揮作用。5.鹽酸普萘洛爾通過線粒體途徑誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡。6.鹽酸普萘洛爾能夠誘導(dǎo)肝癌細胞自噬,增加自噬流的產(chǎn)生。7.鹽酸普萘洛爾通過阻斷β腎上腺素能受體信號通路負向調(diào)節(jié)細胞自噬。8.鹽酸普萘洛爾引起的肝癌細胞的凋亡和自噬之間互相制約。結(jié)論本研究以肝癌細胞為研究對象,證明了鹽酸普萘洛爾可以通過對β腎上腺素能受體的作用控制肝癌細胞的生長。通過實驗,我們發(fā)現(xiàn),一方面,β腎上腺素能受體的確在肝癌細胞中表達升高,使用非選擇性β腎上腺素能受體阻斷劑鹽酸普萘洛爾可以通過對β腎上腺素能受體的作用抑制肝癌細胞增殖、抑制肝癌細胞遷移及侵襲;另一方面,鹽酸普萘洛爾可以同時誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡和自噬,二者相互拮抗。我們的研究首次全面分析報道了鹽酸普萘洛爾在體外對肝癌細胞增殖、侵襲和遷移、細胞凋亡和細胞自噬的作用,并初步探討了其作用機制。這為β腎上腺素能受體信號通路在肝癌發(fā)生機制的基礎(chǔ)研究提供了線索,同時也為臨床探索肝癌藥物輔助療法(鹽酸普萘洛爾的抗腫瘤作用)找到了新的方向。創(chuàng)造性成果:鹽酸普萘洛爾體外可抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲,可誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡和細胞自噬,具有抗腫瘤作用。新見解:鹽酸普萘洛爾有抗肝癌作用。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.7
【圖文】：

天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文 一、鹽酸普萘洛爾抑制肝癌細胞增殖明顯下降（P＜0.05）。160μmol/L 和 320μmol/L 的鹽酸普萘洛爾使 HepG2.2.15細胞貼壁細胞體積明顯縮小，鏡下可見大量細胞漂浮，本研究不對其進行細胞增殖率的統(tǒng)計。（圖 1.4）（3）SMMC-7721 細胞：40、80、160μmol/L 鹽酸普萘洛爾作用 36h 開始出現(xiàn)細胞增殖率降低（P＜0.05）。320μmol/L 的鹽酸普萘洛爾處理 6 小時使SMMC-7721 細胞貼壁細胞體積明顯縮小，鏡下可見大量細胞漂浮，本研究不對其進行細胞增殖率的統(tǒng)計。（圖 1.5）（4）HL-7702 細胞：小于 160μmol/L 的鹽酸普萘洛爾作用 48h 均無抑制作用（P＞0.05）。在 20μmol/L 的鹽酸普萘洛爾作用 30h、36h、42h 和 160μmol/L的鹽酸普萘洛爾作用 30h、36h 還有一定的刺激增殖的作用（P＜0.05）。320μmol/L的鹽酸普萘洛爾使 HL-7702 細胞貼壁細胞體積明顯縮小，鏡下可見大量細胞漂浮，本研究不對其進行細胞增殖率的統(tǒng)計。（圖 1.6）

圖 1.3 鹽酸普萘洛爾對 HepG2 細胞增殖抑制的鏡下表現(xiàn)圖注：20μmol/L 的鹽酸普萘洛爾作用于 HepG2 細胞后 18h 開始出現(xiàn)細胞增殖率的降低。40μmol/L、80μmol/L 的鹽酸普萘洛爾作用于 HepG2 細胞后各時間點均出現(xiàn)細胞增殖率的減低，以 48h 最為明顯。80μmol/L 的鹽酸普萘洛爾作用于 HepG2 細胞后 48 小時可見細胞體積的縮小，有少量細胞與周圍的細胞脫離、漂浮。160μmol/L 的鹽酸普萘洛爾作用于 HepG2細胞 6 小時后即可見貼壁細胞體積明顯縮小，鏡下可見大量細胞漂浮。

天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文 一、鹽酸普萘洛爾抑制肝癌細胞增殖圖 1.4 鹽酸普萘洛爾對 HepG2.2.15 細胞增殖抑制的鏡下表現(xiàn)圖注： 40μmol/L 的鹽酸普萘洛爾作用于 HepG2.2.15 細胞后 18h 開始出現(xiàn)細胞增殖率降低。80μmol/L 的鹽酸普萘洛爾作用于 HepG2.2.15 細胞后各時間點均出現(xiàn)細胞增殖率的減低，以48h 最為明顯。160μmol/L 的鹽酸普萘洛爾作用于 HepG2.2.15 細胞 12 小時后即可見貼壁細胞體積明顯縮小，鏡下可見大量細胞漂浮。

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本文編號：2790475