發(fā)布時(shí)間：2020-08-12 05:56

【摘要】：目的建立對(duì)吉西他濱耐藥(gemcitabine-resistant,GR)的人胰腺癌細(xì)胞株作為研究對(duì)象,觀察耐藥細(xì)胞株與親本細(xì)胞株之間形態(tài)和惡性生物學(xué)行為的差異,探討miR-223調(diào)控胰腺癌耐藥的可能分子機(jī)制,以及miR-223抑制劑聯(lián)合大豆異黃酮協(xié)同改善胰腺癌對(duì)化療藥物吉西他濱的耐藥作用。方法1.長期持續(xù)吉西他濱誘導(dǎo)的方法建立胰腺癌耐藥細(xì)胞株,包括AsPC-1 GR、PANC-1 GR和BxPC-3 GR細(xì)胞;利用MTT檢測細(xì)胞活力的方法驗(yàn)證耐藥細(xì)胞株的建立;顯微鏡下觀察耐藥細(xì)胞與親本胰腺癌細(xì)胞之間形態(tài)的差異;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測耐藥細(xì)胞與親本細(xì)胞之間細(xì)胞遷移和侵襲能力的差異;細(xì)胞粘附和脫落實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證耐藥細(xì)胞與親本細(xì)胞之間細(xì)胞粘附和脫落的改變;qRT-PCR和蛋白印跡技術(shù)檢測EMT特異性標(biāo)志物的改變,包括E-cadherin、Vimentin、Snail、Slug、ZEB1和ZEB2。2.qRT-PCR檢測miR-223在人胰腺癌細(xì)胞和其耐藥細(xì)胞之間表達(dá)的差異;向胰腺癌AsPC-1 GR和PANC-1 GR細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-223抑制劑后觀察細(xì)胞形態(tài)的改變,qRT-PCR和蛋白印跡技術(shù)檢測EMT標(biāo)志物mRNA和蛋白水平改變;此外劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞脫落和粘附實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染miR-223抑制劑后,AsPC-1 GR和PANC-1 GR細(xì)胞遷移和侵襲能力的差異、細(xì)胞脫落和粘附的改變;qRT-PCR和蛋白印跡方法檢測轉(zhuǎn)染mi R-223抑制劑后,AsPC-1 GR和PANC-1 GR細(xì)胞內(nèi)FBW7和Notch1的改變;下調(diào)miR-223后,利用MTT的方法檢測AsPC-1GR和PANC-1 GR細(xì)胞對(duì)化療藥物吉西他濱敏感性的影響。3.MTT檢測大豆異黃酮對(duì)人胰腺癌AsPC-1 GR和BxPC-3 GR細(xì)胞生長的抑制作用;qRT-PCR檢測大豆異黃酮對(duì)AsPC-1 GR和BxPC-3 GR細(xì)胞miR-223表達(dá)的影響;miR-223抑制劑與大豆異黃酮聯(lián)合應(yīng)用,實(shí)驗(yàn)分組如下:對(duì)照組、miR-223抑制劑組、大豆異黃酮組、miR-223抑制劑與大豆異黃酮聯(lián)合應(yīng)用組,觀察這4組對(duì)AsPC-1 GR和Bx PC-3 GR細(xì)胞形態(tài)改變、EMT標(biāo)志物mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響;按照上述分組檢測AsPC-1 GR和BxPC-3 GR細(xì)胞中FBW7和Notch1的影響;按照上述分組檢測AsPC-1 GR和BxPC-3 GR細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的改變,包括細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞遷移和侵襲能力的差異,以及細(xì)胞粘附和脫落實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證各組細(xì)胞脫落和粘附的差異;MTT檢測miR-223抑制劑和大豆異黃酮聯(lián)合應(yīng)用后,AsPC-1 GR和BxPC-3 GR細(xì)胞對(duì)化療藥物吉西他濱的敏感性改變的影響。結(jié)果:1.耐藥細(xì)胞株的建立:逐漸增加吉西他濱的濃度持續(xù)誘導(dǎo)細(xì)胞超過六個(gè)月,最終細(xì)胞能夠達(dá)到穩(wěn)定生長,其中AsPC-1細(xì)胞株最終誘導(dǎo)濃度為100μM,PANC-1的最終誘導(dǎo)濃度達(dá)到5μM,而BxPC-3細(xì)胞的最終誘導(dǎo)濃度為6μM;MTT結(jié)果顯示,最終誘導(dǎo)濃度的吉西他濱對(duì)親本細(xì)胞的生長出現(xiàn)明顯抑制,而對(duì)耐藥細(xì)胞株沒有明顯的抑制作用;顯微鏡下觀察3株人胰腺癌細(xì)胞形態(tài)的改變,發(fā)現(xiàn)原始的親本細(xì)胞形態(tài)短、圓,耐藥株細(xì)胞的形態(tài)變細(xì)長,呈梭形,細(xì)胞由上皮形態(tài)特征向間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化(EMT);細(xì)胞劃痕和transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,耐藥株比親本細(xì)胞具有更明顯的遷移能力;Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示,耐藥細(xì)胞的侵襲能力明顯高于親本細(xì)胞;細(xì)胞粘附和脫落實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,耐藥細(xì)胞株比親本細(xì)胞顯示出更明顯的粘附和脫落能力;此外,EMT標(biāo)志物檢測結(jié)果顯示體現(xiàn)上皮細(xì)胞特征的標(biāo)志物E-caderin的mRNA和蛋白水平在耐藥細(xì)胞株中是顯著下調(diào)的,而反映間質(zhì)細(xì)胞特征的標(biāo)志物Vimentin和EMT-TFs如Slug、Snail、ZEB1和ZEB2的mRNA和蛋白水平顯著升高。2.與其親本細(xì)胞相比,我們所誘導(dǎo)的3株胰腺癌耐藥細(xì)胞株均高表達(dá)miR-223,提示miR-223可能與耐藥的發(fā)生有關(guān);使用miR-223抑制劑下調(diào)AsPC-1GR和PANC-1 GR細(xì)胞內(nèi)miR-223表達(dá)后,顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生逆轉(zhuǎn),從細(xì)長的梭形向短、圓形轉(zhuǎn)變,即由間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)向上皮細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化(MET);miR-223抑制劑作用后,AsPC-1 GR和PANC-1 GR細(xì)胞上皮細(xì)胞標(biāo)志物分子E-cadherin的轉(zhuǎn)錄水平明顯升高,而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào),同樣,E-cadherin的蛋白水平明顯上升,而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin和EMT-TFs如snail、slug、ZEB1以及ZEB2的蛋白表達(dá)水平明顯下降;.下調(diào)miR-223表達(dá)后,劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)顯示AsPC-1 GR和PANC-1 GR細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力下降;而細(xì)胞粘附和脫落實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,miR-223下調(diào)后能夠降低耐藥細(xì)胞的粘附和脫落能力;為了明確FBW7是否參與耐藥細(xì)胞EMT的調(diào)控,我們首先檢測耐藥細(xì)胞株和親本細(xì)胞株之間FBW7的表達(dá)差異,然后檢測耐藥細(xì)胞株在轉(zhuǎn)染miR-223抑制劑后對(duì)FBW7表達(dá)的影響,qRT-PCR和蛋白印跡結(jié)果顯示,AsPC-1GR和PANC-1 GR細(xì)胞中FBW7的mRNA和蛋白水平均低于其親本細(xì)胞;下調(diào)耐藥細(xì)胞株miR-223表達(dá)后,FBW7的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于其轉(zhuǎn)染對(duì)照序列組,說明miR-223下調(diào)可以明顯升高耐藥細(xì)胞株中FBW7的表達(dá);利用蛋白印跡的方法又進(jìn)一步檢測了FBW7的底物分子Notch1的表達(dá),發(fā)現(xiàn)AsPC-1 GR和PANC-1 GR細(xì)胞株中Notch1表達(dá)要明顯高于其親本細(xì)胞,且在轉(zhuǎn)染mi R-223抑制劑后,Notch1的蛋白表達(dá)水平明顯低于其轉(zhuǎn)染對(duì)照序列的細(xì)胞,這些結(jié)果提示,耐藥細(xì)胞株EMT的過程可能與低表達(dá)的FBW7和高表達(dá)的Notch1有關(guān);MTT結(jié)果顯示在AsPC-1 GR和PANC-1 GR細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-223抑制劑后,可以明顯增強(qiáng)對(duì)化療藥物吉西他濱的敏感性。3.大豆異黃酮對(duì)耐藥細(xì)胞株AsPC-1 GR和BxPC-3 GR細(xì)胞具有明顯的生長抑制的作用,具有濃度依賴性;大豆異黃酮可以顯著下調(diào)AsPC-1 GR和Bx PC-3 GR細(xì)胞株中miR-223的表達(dá);顯微鏡下觀察到不管是miR-223抑制劑組,還是大豆異黃酮組,以及聯(lián)合應(yīng)用組,細(xì)胞形態(tài)都由細(xì)長的間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檩^短較圓的上皮細(xì)胞,而且聯(lián)合應(yīng)用組對(duì)細(xì)胞形態(tài)的逆轉(zhuǎn)作用比單獨(dú)使用mi R-223抑制劑或是單獨(dú)使用大豆異黃酮都更為明顯;qRT-PCR和WB結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,其他3組中上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-caderin的表達(dá)升高,其中聯(lián)合應(yīng)用組細(xì)胞中E-caderin的蛋白表達(dá)升高最為顯著,高于大豆異黃酮和miR-223抑制劑單獨(dú)處理組,而如Slug,Snail,ZEB1,ZEB2和Vimentin等蛋白的表達(dá)變化正好與E-caderin的趨勢相反;大豆異黃酮和miR-223抑制劑都可以升高FBW7的表達(dá),降低Notch1的表達(dá),而大豆異黃酮和miR-223抑制劑的聯(lián)合應(yīng)用升高FBW7,降低Notch1蛋白水平的效果更為明顯,超過兩者單獨(dú)應(yīng)用的效果;惡性生物學(xué)行為檢測結(jié)果顯示,大豆異黃酮、miR-223抑制劑、以及兩者聯(lián)合應(yīng)用這3組對(duì)細(xì)胞遷移、侵襲、粘附和脫落的抑制程度都超過對(duì)照組細(xì)胞,其中聯(lián)合應(yīng)用組最明顯,說明兩者聯(lián)合應(yīng)用可以發(fā)揮協(xié)同抑制作用;大豆異黃酮和miR-223 inbibitor的聯(lián)合應(yīng)用比起單獨(dú)應(yīng)用能夠更有效的提高對(duì)化療藥物的敏感性。結(jié)論:人胰腺癌耐藥細(xì)胞株形態(tài)的改變、更強(qiáng)的遷移和侵襲能力、粘附和脫落能力、EMT標(biāo)志物的變化結(jié)果都說明耐藥細(xì)胞株發(fā)生了EMT的轉(zhuǎn)化,提示人胰腺癌對(duì)吉西他濱的耐藥性可能與EMT的發(fā)生有關(guān)。miR-223在調(diào)控耐藥相關(guān)的EMT過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,下調(diào)miR-223的表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞EMT,降低耐藥細(xì)胞的遷移和侵襲、粘附和脫落能力,改善耐藥情況,提高耐藥細(xì)胞對(duì)化療藥物吉西他濱的療效。miR-223調(diào)控耐藥細(xì)胞的EMT可能與細(xì)胞中FBW7的下調(diào),Notch1的上調(diào)有關(guān)。下調(diào)miR-223可能是臨床上治療胰腺癌,改善胰腺癌耐藥的一個(gè)潛在途徑。miR-223抑制劑和大豆異黃酮聯(lián)合應(yīng)用,可以發(fā)揮協(xié)同作用,比起兩者的單獨(dú)應(yīng)用,能夠更為有效的逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞的EMT,更為有效的抑制耐藥細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移,更為有效的提高耐藥細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。因此,miR-223抑制劑和大豆異黃酮的聯(lián)合應(yīng)用可能是一個(gè)潛在的治療胰腺癌的有效措施。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.9
【圖文】：

：AsPC-1 細(xì)胞和 AsPC-1 GR 細(xì)胞的 MTT 檢測，B：PANC-1 細(xì)胞和 PANC-1 GR 細(xì)胞MTT 檢測，C：BxPC-3 細(xì)胞和 BxPC-3 GR 細(xì)胞的 MTT 檢測圖 1-1 MTT 檢測人胰腺癌細(xì)胞及其耐藥細(xì)胞的活力

A：AsPC-1 細(xì)胞和 AsPC-1 GR 細(xì)胞的形態(tài)，B：PANC-1 細(xì)胞和 PANC-1 GR 細(xì)胞的形態(tài)，C：BxPC-3 細(xì)胞和 BxPC-3 GR 細(xì)胞的形態(tài)圖 1-2 顯微鏡下觀察人胰腺癌親本和耐藥細(xì)胞形態(tài)變化

MiR-223 調(diào)控胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他，顯微鏡下觀察創(chuàng)傷大小并拍照。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，細(xì)胞劃痕株的創(chuàng)傷面積明顯比親本細(xì)胞小（見圖 1-3）由此可見，吉西耐藥細(xì)胞表現(xiàn)出比其親本細(xì)胞更強(qiáng)的遷移能力。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 ;Inhibitory effects of genistein on metastasis of human hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2009年39期

2 Hitoshi Iwamoto;;Genistein inhibits invasive potential of human hepatocellular carcinoma by altering cell cycle, apoptosis, and angiogenesis[J];World Journal of Gastroenterology;2005年41期

3 ;Apoptosis of human primary gastric carcinoma cells induced by genistein[J];World Journal of Gastroenterology;2004年12期

本文編號(hào)：2790140