【摘要】：研究背景及目的膽囊癌在消化道惡性腫瘤中發(fā)病率排名第6位,其預(yù)后極差,死亡率接近發(fā)病率。膽囊癌早期缺乏特異性臨床表現(xiàn),如今根治性手術(shù)切除是唯一的治愈手段,但術(shù)后易出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移�；蛲蛔冊谀[瘤發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用,而對于腫瘤驅(qū)動基因的研究不僅揭示腫瘤發(fā)生的原因,更重要的是可以以此為切入點,探索治療方式。環(huán)指蛋白43(Ring finger protein 43,RNF43)作為Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制因子,在個體發(fā)育、細胞增殖分化等方便發(fā)揮重要調(diào)控作用。RNF43在膽囊癌中存在較高的突變頻率,與膽囊癌的發(fā)生具有密切關(guān)系,值得進一步研究。方法1.通過TOPflash/FOPflash雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)實驗及qPCR檢測Wnt通路下游靶基因轉(zhuǎn)錄變化,明確RNF43對Wnt通路的抑制作用,確定Y332*點突變對RNF43功能的影響。2.體外細胞學(xué)實驗探究RNF43及其突變體Y332*對膽囊癌細胞增殖、侵襲能力的影響。3.結(jié)合蛋白交聯(lián)、串聯(lián)親和純化及串聯(lián)質(zhì)譜,確定RNF43的相互作用蛋白,并通過CO-IP驗證RNF43點突變Y332*對蛋白互作的影響。4.通過Real-Time qPCR檢測40例膽囊癌患者癌與癌旁組織中RNF43表達情況,并與患者預(yù)后及臨床病理信息進行綜合分析,探究RNF43的功能變化與膽囊癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后轉(zhuǎn)歸的關(guān)系。結(jié)果1.RNF43在膽囊癌細胞中對Wnt信號通路具有抑制作用;2.RNF43截短突變Y332*對Wnt信號通路的抑制作用部分缺失,可能和其DVL結(jié)合結(jié)構(gòu)域缺失有關(guān);3.體外細胞學(xué)實驗發(fā)現(xiàn),RNF43及點突變Y332*對膽囊癌細胞系的增殖遷移功能沒有明顯影響;4.發(fā)現(xiàn)RNF43能與蛋白PRMT5相互作用,而Y332*突變可削弱二者的結(jié)合能力;5.通過膽囊癌mRNA差異表達檢測發(fā)現(xiàn)RNF43表達在癌與癌旁組織中差異不顯著;6.RNF43的表達水平與膽囊癌的發(fā)展及患者的預(yù)后無明顯相關(guān)性。結(jié)論雖然本研究結(jié)果未見RNF43與膽囊癌的發(fā)展具有相關(guān)性,但仍不能排除RNF43的功能缺失在膽囊上皮惡變過程中的作用。
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.8
【圖文】：

上海交通大學(xué)博士學(xué)位論文2.2.2.2 瓊脂糖凝膠配制及 PCR 產(chǎn)物電泳稱取 0.3 g 瓊脂糖粉末，加入 30 ml 1×TAE 緩沖液中，混勻后放入微波爐中高火加熱 30 秒，反復(fù) 3 次，確定瓊脂糖充分溶解后取出。室溫冷卻至 50℃左右，加入 3 μl GEL-RED 染液，充分混勻后倒入模具，插上合適寬度的齒梳，室溫冷卻 30 分鐘。PCR 產(chǎn)物中加入 6×DNA Loading Buffer 至 1×濃度，混勻后加入凝膠的上樣孔中。在 1×TAE 緩沖液中，120V 恒壓電泳 30 分鐘。結(jié)束電泳后在紫外切膠儀下切下目的條帶，置入 1.5ml effendorf 管中。2.2.2.3 凝膠內(nèi) DNA 回收將凝膠用槍頭搗碎后稱重，加入凝膠 3 倍體積的 buffer A（100 mg=100 μl），置于 70℃金屬浴中加熱 6-8 分鐘，直至凝膠充分溶解。每 2 分鐘顛倒震蕩一次EP 管。加入 buffer A 體積一般的 buffer B，確保溶液顏色完全由紅變黃。將溶液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，14000 g 室溫離心 30 秒，棄去收集管內(nèi)的液體。加入 500 μlPW1，14000 g 室溫離心 30 秒。再加入 700 μl PW2，14000g 室溫離心 30 秒。重復(fù) 1 次后，吸附柱空轉(zhuǎn)離心 1 分鐘，以保證 PW2 中的乙醇徹底除去。加入 25 μlElution Buffer，室溫靜置 1 分鐘后，14000 g 離心 1 分鐘。收集洗脫液，用 NanoDrop 2000 測定 DNA 濃度及純度。2.2.2.4 質(zhì)粒載體及 PCR 產(chǎn)物雙酶切

上海交通大學(xué)博士學(xué)位論文將 20 μl 裂解液加入 96 孔板中，上機檢測。螢火蟲熒光素酶底物每孔加入 50 μl，檢測后再加入反應(yīng)終止液和海腎熒光素酶底物。繼續(xù)檢測。海腎熒光值矯正各孔螢火蟲熒光值后，用同一處理的 TOPflash 組與 Fopflash 組的螢火蟲熒光的比值表示 Wnt 通路激活程度。3 實驗結(jié)果3.1 RNF43 及 Y332*突變質(zhì)粒構(gòu)建及表達效率驗證我們?yōu)檠芯?RNF43 蛋白及 Y332*突變的結(jié)構(gòu)及功能，首先構(gòu)建了相應(yīng)的過表達質(zhì)粒。并通過免疫熒光及 WB 驗證質(zhì)粒在膽囊癌細胞系 GBC-SD 中的表達情況。結(jié)果顯示，RNF43 及截短突變在細胞內(nèi)成功過表達，且均主要分布于細胞胞膜及胞漿中（圖 2）。而 WB 實驗發(fā)現(xiàn) RNF43 及突變體存在較多降解條帶，可能是在細胞中發(fā)生內(nèi)源性降解(圖 3)。考慮到負反饋調(diào)控的實時性，即 Wnt 通路激活程度較低時，體內(nèi) RNF43 本身的穩(wěn)定性可能較低，易發(fā)生 RNF43 蛋白降解所致。RNF43 Y332*由于截短突變導(dǎo)致蛋白肽鏈長度縮短，故分子量變小(圖 3)。

圖 3. GBC-SD 中過表達 RNF43 及 Y332*突變的 WB 條帶3. The WB bands of RNF43 and Y332* mutant which overexpressed in GB表達水平及突變在膽囊癌細胞系中的情況合適的實驗細胞系，我們對 5 株膽囊癌細胞系進行 RNF43 編碼果發(fā)現(xiàn)，5 株膽囊癌細胞系均含有 RNF43 點突變，但并未發(fā)現(xiàn)變均屬于但單核苷酸多態(tài)性。其中細胞系 NOZ 突變較少。同量 PCR（real time qPCR）檢測了 5 株膽囊癌細胞系中 RNF4 信號通路的激活水平。結(jié)果顯示，NOZ 細胞中 RNF43 表達水平時，Wnt 通路中下游調(diào)控基因 AXIN2、MYC 在 NOZ 細胞中亦有見 Wnt 通路在 NOZ 細胞中激活水平較其它細胞株高。因此我們胞系進行進一步研究。表 1：膽囊癌細胞系 RNF43 編碼區(qū)點突變情況細胞系 突變GBC-SD c.a139g c.c1252aNOZ c.g350aSGC996 c.c1854g(雜合)OCUG c.a139g c.c1252a

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