【摘要】：研究背景：腎細(xì)胞癌是最常見的腎臟惡性實(shí)體腫瘤,是起源于腎實(shí)質(zhì)泌尿小管上皮的惡性腫瘤。’腎細(xì)胞約占成人惡性腫瘤的2%-3%,目前臨床上出現(xiàn)血尿、腰痛、腹部腫塊的典型“腎癌三聯(lián)征”的已經(jīng)不到6%-10%,在腎癌患者中約30%為晚期腫瘤,大約30%的局限性腎癌患者術(shù)后出現(xiàn)轉(zhuǎn)移；目前對(duì)于局限性腎細(xì)胞癌的主要治療方法為手術(shù)切除,而對(duì)于那些確診時(shí)即出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶或者晚期腎癌的治療效果并不理想,目前階段的治療手段包括放化療以及免疫治療和分子靶向治療等。腎細(xì)胞癌中的絕大多數(shù)病理類型為腎透明細(xì)胞癌,約占60%-85%,作為腺癌的一種,其對(duì)于放療、化療均不敏感,而靶向藥物的臨床應(yīng)用,明顯提高了患者的生存期。目前的靶向藥物如索拉菲尼、舒尼替尼等多基于選擇性的抑制3或者KIT、VEGFR-1等作用于腎癌細(xì)胞的多種信號(hào)通路從而發(fā)揮抗腫瘤作用,其中最重要的通路就是Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑。如何提高抑制Notch通路的抑制效率是當(dāng)前的研究熱點(diǎn),目前對(duì)于Notch通路靶向抑制多基于Notch通路受體及配體合成的抑制,而此類抑制劑對(duì)于Notch信號(hào)通路激活的三個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)影響有限。國外研究報(bào)道的針對(duì)Notch通路激活位點(diǎn)多集中于S3位點(diǎn),比較有代表性的抑制劑為Y分泌酶抑制劑。ADAM-17又名TACE作為一種早期發(fā)現(xiàn)的TNF-α抑制劑,研究表明,在白血病中Notch1蛋白的釋放依賴于ADAM-17對(duì)于Notch信號(hào)途徑的作用,揭示了ADAM-17在Notch通路中的重要作用,其在Notch通路S2位點(diǎn)中起到了關(guān)鍵酶的作用。ADAM-17作為天然金屬蛋白的一種,而Marimastat,是金屬蛋白酶家族中唯一可抑制TACE的蛋白,Marimastat主要作用是能緊密連接基底膜,抑制TNF-α轉(zhuǎn)化酶,通過穩(wěn)定細(xì)胞表面TNF-α受體誘導(dǎo)程序性死亡。而由于其對(duì)抗TACE (ADAM-17)的作用,其通過Notch信號(hào)通路對(duì)腫瘤也引起了廣泛關(guān)注。我們實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路為,與ADAM-17在胞外S2位點(diǎn)的切割效應(yīng)相比,Y分泌酶對(duì)Notch的S3位點(diǎn)切割位于跨膜區(qū),跨膜區(qū)可以收到有多種信號(hào)通路的影響,由于腫瘤細(xì)胞信號(hào)通路是一個(gè)復(fù)雜的立體的結(jié)構(gòu),各信號(hào)通路有許多已知的、未知的相互影響,應(yīng)用Y分泌酶抑制劑針對(duì)跨膜區(qū)Y分泌酶的作用不可避免的產(chǎn)生對(duì)其他信號(hào)通路的影響；而對(duì)于位于胞外區(qū)的S2位點(diǎn)來說,其受到影響的可能性遠(yuǎn)比S3位點(diǎn)要小,所以,針對(duì)S2位點(diǎn)的阻滯應(yīng)該會(huì)有更強(qiáng)的具有的特異性,與Y分泌酶抑制劑相比針對(duì)ADAM-17進(jìn)行抑制,在Notch通路中可以達(dá)到更好的抑制效果,對(duì)未來腎細(xì)胞癌的靶向抑制提供新的思路。研究目的：腎腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚不清楚,Notch信號(hào)通路被認(rèn)為在其中起到重要作用,本研究旨在研究Notch通路關(guān)鍵酶ADAM-17 (TACE)在腎癌組織中的表達(dá)以及Notch通路的兩種抑制劑對(duì)腎癌786-0細(xì)胞以及OS-RC-2細(xì)胞增殖以及細(xì)胞侵襲影響的特異性研究方法：1、ADAM-17在腎癌組織中的表達(dá)1.1腎癌組織的提取我們收集2011年10月至2012年12月于山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院泌尿微創(chuàng)科入住的腎腫瘤患者手術(shù)標(biāo)本共67例,所有診斷由山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院病理科石蠟切片確診,同時(shí)收集癌旁正常腎臟組織共10例；手術(shù)方式為開放腎癌根治性切除術(shù)或者手助腹腔鏡腎癌根治性切除術(shù)。手術(shù)患者均采用2009年AJCC的TNM分期和2004 WHO分級(jí)系統(tǒng)評(píng)價(jià)腎癌的臨床分期,并根據(jù)臨床分期進(jìn)行分組。1.2腎癌組織中ADAM-17的免疫組化檢測(cè)收集腎癌組織標(biāo)本及正常腎臟組織標(biāo)本后,選用兔抗人ADAM-17多克隆抗體,嚴(yán)格按照Super Polymer-二步法IHC試劑盒的方法進(jìn)行脫蠟水化、抗原修復(fù)、IHC試劑盒實(shí)驗(yàn)、蘇木精復(fù)染、DAB顯色、脫水透明、顯微成像系統(tǒng)拍照。ADAM-17陽性表達(dá)主要集中在細(xì)胞膜周圍,染色為棕紅色,而正常腎臟組織中腎臟細(xì)胞排列規(guī)整,無核分裂像,細(xì)胞周圍無此類染色表達(dá)情況,并統(tǒng)計(jì)陽性例數(shù)。1.3 Western blot方法檢測(cè)不同分期腎癌組織中ADAM-17的表達(dá)情況我們將收集的腎癌組織根據(jù)不同臨床分期進(jìn)行分組,其中臨床Ⅰ期、Ⅱ期腎癌組織作為一組、ⅡI期與Ⅳ期作為一組,正常腎臟組織作為一組,不同分期腎癌組織隨機(jī)抽取3例,分別提取總蛋白,腎癌組與正常腎組織組分別進(jìn)行Western blot檢測(cè)觀察各組ADAM-17蛋白表達(dá)情況。以GAPDH作為內(nèi)參照,以各組ADAM-17與GAPDH的比值表示各組ADAM-17蛋白表達(dá)水平。用掃描儀掃描膠片得到各個(gè)蛋白條帶圖,將得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入IPP 6.0圖像處理軟件,通過軟件中的count/size算出各蛋白個(gè)條帶的光密度值IOD(Integral OpticalDensity),然后計(jì)算各個(gè)目的蛋白條帶和與之相對(duì)應(yīng)的內(nèi)參條帶的灰度值的比。1.4流式細(xì)胞術(shù)PI單染法分析ADAM-17陽性表達(dá)的腎細(xì)胞癌組織的細(xì)胞周期根據(jù)免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的結(jié)果,我們選�、笃谂cⅣ期ADAM-17 β日性表達(dá)腎細(xì)胞癌與陰性表達(dá)的腎癌組織作比較,應(yīng)用PI單染法分析ADAM-17陽性表達(dá)的腎細(xì)胞癌組織中細(xì)胞周期情況。取新鮮瘤組織0.5cm3,加入PBS液適量,離心后于4℃固定12小時(shí),再次離心,取上清,使細(xì)胞計(jì)數(shù)在1×106個(gè)/ml。取懸液50u1,加入PI100u1,染色20min以上,上機(jī)測(cè)定5×103個(gè)細(xì)胞,并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期中G0/G1期、S期及G2/M期的細(xì)胞所占的比例。 同等條件下重復(fù)試驗(yàn)3次。2、抑制ADAM-17對(duì)腎癌Notch通路調(diào)控特異性的研究2.1腎癌細(xì)胞株的選擇我們選取腎癌786-0細(xì)胞株以及腎癌OS-RC-2細(xì)胞株,二者均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫。兩類細(xì)胞均嚴(yán)格按照細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)程進(jìn)行復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代以及凍存。2.2實(shí)驗(yàn)試劑處理及細(xì)胞分組ADAM-17抑制劑Marimastat規(guī)格lmg購自英國Tocris公司；DAPT規(guī)格5mg購自美國EMD bioscience公司。將Marimastat及DAPT試劑于常溫下解凍,分別溶于DMSO中,根據(jù)體積比配置成Marimastat 1μmol/L,2μmol/L,3μmol/L以及DAPT 1μmol/L, 2μmol/L,3μmol/濃度溶液4℃冰箱保存待用。于細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)各濃度試劑均取2m1加入處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的786-0以及OS-RC-2細(xì)胞內(nèi)處理24h作為實(shí)驗(yàn)組；對(duì)照組僅加入2m11640培養(yǎng)基。2.3 Western blot方法檢測(cè)兩類抑制劑對(duì)786-0細(xì)胞以及OS-RC-2細(xì)胞Notch通路的影響我們分別將不同濃度的Marimastat以及DAPT加入到培養(yǎng)中的786-0細(xì)胞以及OS-RC-2細(xì)胞中,對(duì)其Notch1、Hes-1蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),取未經(jīng)處理的細(xì)胞作為對(duì)照組作比較,蛋白下降程度我們用測(cè)量的蛋白濃度-對(duì)照組蛋白濃度計(jì)算,下降程度均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(x±6),實(shí)驗(yàn)步驟參考方法1.3進(jìn)行。2.4 CCK-8法檢測(cè)經(jīng)兩類抑制劑處理后的細(xì)胞增殖情況取經(jīng)過不同濃度Marimastat以及DAPT處理后的786-0細(xì)胞以及OS-RC-2細(xì)胞,均以3x105／mL的密度種于普通96孔板中,每孔加入100 μ 1細(xì)胞懸液。24h后用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力。酶標(biāo)儀于450nnm處檢測(cè)0D值情況。下降程度以實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)減去對(duì)照組數(shù)據(jù),取各組實(shí)驗(yàn)值的均數(shù)表示,每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。同時(shí)比較兩組細(xì)胞中兩類抑制劑的線性相關(guān)性以及抑制程度大小。2.5 Transwell侵襲小室檢測(cè)兩類抑制劑對(duì)786-0細(xì)胞侵襲性的影響Transwell試劑盒購買自美國Corning公司。我們選取腎癌786-0細(xì)胞分別經(jīng)1μmol/L, 2μmol/L,3μmol/L的Marimastat以及相同濃度DAPT處理,對(duì)照組不進(jìn)行任何處理,經(jīng)過Transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn),在400倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)5個(gè)視野觀察穿過聚碳酸酯膜細(xì)胞的個(gè)數(shù), 以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±σ)表示。2.6流式細(xì)胞術(shù)AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)兩類抑制劑對(duì)786-0細(xì)胞凋亡率的影響我們將腎癌786-0細(xì)胞用1μmol/L,3μmol/L的Marimastat與DAPT進(jìn)行處理,應(yīng)用同體積的DMSO (15μ1)作為對(duì)照組,進(jìn)行Annexin Ⅴ-PI染色后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)不同濃度Marimastat以及DAPT處理后的786-0細(xì)胞凋亡率變化。結(jié)果判讀：Modfit軟件分析中我們?nèi)2+Q4象限被染為紅色的細(xì)胞比例之和作為細(xì)胞凋亡率指標(biāo)。以上同等條件下重復(fù)試驗(yàn)3次。2.7統(tǒng)計(jì)分析所有指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,采用SPSS17.0軟件(SPSS Inc. Chicago, IL,美國)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量數(shù)值以x±s表示,根據(jù)需要選用配對(duì)資料的t檢驗(yàn)或ANOVA方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,選用雙側(cè)檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料相關(guān)性檢測(cè)采用χ2檢驗(yàn)以及一元性線性回歸分析,取P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：1.ADAM-17在腎癌組織中的表達(dá)全部67例不同分期腎細(xì)胞癌組織及正常腎組織均完成正常免疫組化程序,我們通過免疫組化染色的方法發(fā)現(xiàn),在不同TNM分期腎癌組織中,ADAM-17呈高表達(dá),全部67例中陽性表達(dá)為43例,占64.18%,而ADAM-17陰性表達(dá)者僅有24例,占35.82%,通過對(duì)上述計(jì)數(shù)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,我們得到,在腎癌組織中,ADAM-17陽性表達(dá)比例增多,差距有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.39 P0.01)。在留取的10例腎癌旁正常的腎臟組織中,ADAM-17無一例呈表達(dá)。在Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期與Ⅳ期ADAM-17陽性表達(dá)的腎癌中,進(jìn)行Western blot檢測(cè),其相對(duì)光密度值分別為Ⅰ期腎癌(0.67±0.11)、Ⅱ期腎癌(0.73±0.31)、Ⅲ期腎癌(0.79±0.25)與Ⅳ期腎癌(0.89±0.09)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,我們可知在ADAM-17陽性表達(dá)的腎癌組織中,隨著腎癌分期的增加,ADAM-17表達(dá)亦相應(yīng)增加(t=18.74 P0.01),且在Ⅳ期腎癌中的表達(dá)有著顯著的增加(0.89±0.09vs 0.79±0.25)。在流式細(xì)胞術(shù)分析腎癌細(xì)胞周期中我們發(fā)現(xiàn)無論Ⅲ期與Ⅳ期ADAM-17陽性表達(dá)或陰性表達(dá)腎細(xì)胞癌,細(xì)胞周期處于G2期的比例均較高,為0.31 vs 0.22,說明高分期腎癌處于核分裂活躍時(shí)期,其惡性程度高；與此同時(shí),我們比較兩組G2期細(xì)胞周期數(shù)據(jù),ADAM-17陽性表達(dá)的腎癌組織對(duì)細(xì)胞周期G2期比例有著明顯上調(diào),于ADAM-17陰性表達(dá)的腎癌組織相比,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=20.76 P0.01)。2.抑制ADAM-17對(duì)腎癌Notch通路調(diào)控特異性的研究我們發(fā)現(xiàn)于無論經(jīng)過Marimastat或者DAPT處理的兩類細(xì)胞,其Notch1、Hes-1蛋白表達(dá)均明顯下降(P0.05),但是,經(jīng)Marimastat處理的786-0細(xì)胞,比較經(jīng)過各濃度DAPT處理后Notchl蛋白、Hes-1蛋白下降更為顯著；在OS-RC-2細(xì)胞中,也得到了相似的結(jié)果,我們認(rèn)為,經(jīng)過Marimastat處理后,腎癌細(xì)胞Notch1、Hes-1蛋白的下降程度,相比經(jīng)DAPT處理后的下降程度要更大(786-0 P0.05, OS-RC-2 P0.05)。并且,在相同濃度(1-4μmol/L)下,經(jīng)過Marimastat處理的兩類細(xì)胞兩種蛋白濃度比較經(jīng)過DAPT處理的下降程度更大,差距有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05 P005)。我們?cè)赾ck-8實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)兩類細(xì)胞經(jīng)過上述兩種抑制劑處理后,其OD值均有明顯下降,與此同時(shí)我們發(fā)現(xiàn),在相同劑量下,經(jīng)過Marimastat處理的786-0細(xì)胞相較于DAPT處理的細(xì)胞,OD值下降程度的更小,而相同的情況也出現(xiàn)在OS-RC-2細(xì)胞里,且經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,差異與計(jì)量呈相關(guān)性(r=0.991, P0.05, r=0.991, P0.05)。在Transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)中,我們將786-0下?lián)芙?jīng)過兩類抑制劑處理后,與對(duì)照組相比,能夠穿過聚碳酸酯膜的細(xì)胞個(gè)數(shù)均有顯著下降,但是,同樣濃度下經(jīng)Marimastat處理的786-0細(xì)胞穿過的數(shù)量更少,,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞凋亡率,經(jīng)過DAPT處理后786-0細(xì)胞凋亡率為3.4%,5.4%,經(jīng)過Marimastat處理786-0細(xì)胞凋亡率為4.5%7.7%；對(duì)照組2.8%。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,經(jīng)過相同濃度Marimastat處理后的786-0細(xì)胞的凋亡率要明顯高于經(jīng)過DAPT處理的兩類細(xì)胞,二者相差有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論：1、ADAM-17在腎癌組織中呈高表達(dá),ADAM-17陽性表達(dá)隨腫瘤分期的增加其表達(dá)相應(yīng)增加2、對(duì)于高分期腎細(xì)胞癌,ADAM-17的陽性表達(dá)能上調(diào)腎癌細(xì)胞增殖,進(jìn)而影響腎癌的侵襲及發(fā)展3、抑制ADAM-17表達(dá)可能成為腎癌靶向治療的新位點(diǎn)4、Marimastat以及DAPT均可以降低Notch1蛋白以及Hes-1蛋白的表達(dá),降低786-0細(xì)胞以及OS-RC-2細(xì)胞的增殖能力,在786-0細(xì)胞中可以降低癌細(xì)胞侵襲性以及提高其凋亡率5、Marimastat對(duì)于兩類細(xì)胞Notch通路、細(xì)胞侵襲性以及細(xì)胞周期及凋亡率的影響比DAPT要更為顯著,Marimastat對(duì)于腎癌細(xì)胞Notch通路影響以及腎癌發(fā)生發(fā)展的過程具有更好的特異性。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.11

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2789412