發(fā)布時間：2020-08-11 18:31

【摘要】：研究背景：腎細胞癌是最常見的腎臟惡性實體腫瘤,是起源于腎實質(zhì)泌尿小管上皮的惡性腫瘤�！I細胞約占成人惡性腫瘤的2%-3%,目前臨床上出現(xiàn)血尿、腰痛、腹部腫塊的典型“腎癌三聯(lián)征”的已經(jīng)不到6%-10%,在腎癌患者中約30%為晚期腫瘤,大約30%的局限性腎癌患者術(shù)后出現(xiàn)轉(zhuǎn)移；目前對于局限性腎細胞癌的主要治療方法為手術(shù)切除,而對于那些確診時即出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶或者晚期腎癌的治療效果并不理想,目前階段的治療手段包括放化療以及免疫治療和分子靶向治療等。腎細胞癌中的絕大多數(shù)病理類型為腎透明細胞癌,約占60%-85%,作為腺癌的一種,其對于放療、化療均不敏感,而靶向藥物的臨床應(yīng)用,明顯提高了患者的生存期。目前的靶向藥物如索拉菲尼、舒尼替尼等多基于選擇性的抑制3或者KIT、VEGFR-1等作用于腎癌細胞的多種信號通路從而發(fā)揮抗腫瘤作用,其中最重要的通路就是Notch信號傳導(dǎo)途徑。如何提高抑制Notch通路的抑制效率是當前的研究熱點,目前對于Notch通路靶向抑制多基于Notch通路受體及配體合成的抑制,而此類抑制劑對于Notch信號通路激活的三個關(guān)鍵位點影響有限。國外研究報道的針對Notch通路激活位點多集中于S3位點,比較有代表性的抑制劑為Y分泌酶抑制劑。ADAM-17又名TACE作為一種早期發(fā)現(xiàn)的TNF-α抑制劑,研究表明,在白血病中Notch1蛋白的釋放依賴于ADAM-17對于Notch信號途徑的作用,揭示了ADAM-17在Notch通路中的重要作用,其在Notch通路S2位點中起到了關(guān)鍵酶的作用。ADAM-17作為天然金屬蛋白的一種,而Marimastat,是金屬蛋白酶家族中唯一可抑制TACE的蛋白,Marimastat主要作用是能緊密連接基底膜,抑制TNF-α轉(zhuǎn)化酶,通過穩(wěn)定細胞表面TNF-α受體誘導(dǎo)程序性死亡。而由于其對抗TACE (ADAM-17)的作用,其通過Notch信號通路對腫瘤也引起了廣泛關(guān)注。我們實驗設(shè)計思路為,與ADAM-17在胞外S2位點的切割效應(yīng)相比,Y分泌酶對Notch的S3位點切割位于跨膜區(qū),跨膜區(qū)可以收到有多種信號通路的影響,由于腫瘤細胞信號通路是一個復(fù)雜的立體的結(jié)構(gòu),各信號通路有許多已知的、未知的相互影響,應(yīng)用Y分泌酶抑制劑針對跨膜區(qū)Y分泌酶的作用不可避免的產(chǎn)生對其他信號通路的影響；而對于位于胞外區(qū)的S2位點來說,其受到影響的可能性遠比S3位點要小,所以,針對S2位點的阻滯應(yīng)該會有更強的具有的特異性,與Y分泌酶抑制劑相比針對ADAM-17進行抑制,在Notch通路中可以達到更好的抑制效果,對未來腎細胞癌的靶向抑制提供新的思路。研究目的：腎腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制尚不清楚,Notch信號通路被認為在其中起到重要作用,本研究旨在研究Notch通路關(guān)鍵酶ADAM-17 (TACE)在腎癌組織中的表達以及Notch通路的兩種抑制劑對腎癌786-0細胞以及OS-RC-2細胞增殖以及細胞侵襲影響的特異性研究方法：1、ADAM-17在腎癌組織中的表達1.1腎癌組織的提取我們收集2011年10月至2012年12月于山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院泌尿微創(chuàng)科入住的腎腫瘤患者手術(shù)標本共67例,所有診斷由山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院病理科石蠟切片確診,同時收集癌旁正常腎臟組織共10例；手術(shù)方式為開放腎癌根治性切除術(shù)或者手助腹腔鏡腎癌根治性切除術(shù)。手術(shù)患者均采用2009年AJCC的TNM分期和2004 WHO分級系統(tǒng)評價腎癌的臨床分期,并根據(jù)臨床分期進行分組。1.2腎癌組織中ADAM-17的免疫組化檢測收集腎癌組織標本及正常腎臟組織標本后,選用兔抗人ADAM-17多克隆抗體,嚴格按照Super Polymer-二步法IHC試劑盒的方法進行脫蠟水化、抗原修復(fù)、IHC試劑盒實驗、蘇木精復(fù)染、DAB顯色、脫水透明、顯微成像系統(tǒng)拍照。ADAM-17陽性表達主要集中在細胞膜周圍,染色為棕紅色,而正常腎臟組織中腎臟細胞排列規(guī)整,無核分裂像,細胞周圍無此類染色表達情況,并統(tǒng)計陽性例數(shù)。1.3 Western blot方法檢測不同分期腎癌組織中ADAM-17的表達情況我們將收集的腎癌組織根據(jù)不同臨床分期進行分組,其中臨床Ⅰ期、Ⅱ期腎癌組織作為一組、ⅡI期與Ⅳ期作為一組,正常腎臟組織作為一組,不同分期腎癌組織隨機抽取3例,分別提取總蛋白,腎癌組與正常腎組織組分別進行Western blot檢測觀察各組ADAM-17蛋白表達情況。以GAPDH作為內(nèi)參照,以各組ADAM-17與GAPDH的比值表示各組ADAM-17蛋白表達水平。用掃描儀掃描膠片得到各個蛋白條帶圖,將得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入IPP 6.0圖像處理軟件,通過軟件中的count/size算出各蛋白個條帶的光密度值IOD(Integral OpticalDensity),然后計算各個目的蛋白條帶和與之相對應(yīng)的內(nèi)參條帶的灰度值的比。1.4流式細胞術(shù)PI單染法分析ADAM-17陽性表達的腎細胞癌組織的細胞周期根據(jù)免疫組化實驗檢測的結(jié)果,我們選取Ⅲ期與Ⅳ期ADAM-17 β日性表達腎細胞癌與陰性表達的腎癌組織作比較,應(yīng)用PI單染法分析ADAM-17陽性表達的腎細胞癌組織中細胞周期情況。取新鮮瘤組織0.5cm3,加入PBS液適量,離心后于4℃固定12小時,再次離心,取上清,使細胞計數(shù)在1×106個/ml。取懸液50u1,加入PI100u1,染色20min以上,上機測定5×103個細胞,并用流式細胞儀檢測細胞周期中G0/G1期、S期及G2/M期的細胞所占的比例。 同等條件下重復(fù)試驗3次。2、抑制ADAM-17對腎癌Notch通路調(diào)控特異性的研究2.1腎癌細胞株的選擇我們選取腎癌786-0細胞株以及腎癌OS-RC-2細胞株,二者均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細胞庫。兩類細胞均嚴格按照細胞培養(yǎng)規(guī)程進行復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代以及凍存。2.2實驗試劑處理及細胞分組ADAM-17抑制劑Marimastat規(guī)格lmg購自英國Tocris公司；DAPT規(guī)格5mg購自美國EMD bioscience公司。將Marimastat及DAPT試劑于常溫下解凍,分別溶于DMSO中,根據(jù)體積比配置成Marimastat 1μmol/L,2μmol/L,3μmol/L以及DAPT 1μmol/L, 2μmol/L,3μmol/濃度溶液4℃冰箱保存待用。于細胞培養(yǎng)時各濃度試劑均取2m1加入處于對數(shù)生長期的786-0以及OS-RC-2細胞內(nèi)處理24h作為實驗組；對照組僅加入2m11640培養(yǎng)基。2.3 Western blot方法檢測兩類抑制劑對786-0細胞以及OS-RC-2細胞Notch通路的影響我們分別將不同濃度的Marimastat以及DAPT加入到培養(yǎng)中的786-0細胞以及OS-RC-2細胞中,對其Notch1、Hes-1蛋白表達進行檢測,取未經(jīng)處理的細胞作為對照組作比較,蛋白下降程度我們用測量的蛋白濃度-對照組蛋白濃度計算,下降程度均數(shù)±標準差表示(x±6),實驗步驟參考方法1.3進行。2.4 CCK-8法檢測經(jīng)兩類抑制劑處理后的細胞增殖情況取經(jīng)過不同濃度Marimastat以及DAPT處理后的786-0細胞以及OS-RC-2細胞,均以3x105／mL的密度種于普通96孔板中,每孔加入100 μ 1細胞懸液。24h后用CCK-8法檢測細胞活力。酶標儀于450nnm處檢測0D值情況。下降程度以實驗組數(shù)據(jù)減去對照組數(shù)據(jù),取各組實驗值的均數(shù)表示,每組實驗均重復(fù)三次。同時比較兩組細胞中兩類抑制劑的線性相關(guān)性以及抑制程度大小。2.5 Transwell侵襲小室檢測兩類抑制劑對786-0細胞侵襲性的影響Transwell試劑盒購買自美國Corning公司。我們選取腎癌786-0細胞分別經(jīng)1μmol/L, 2μmol/L,3μmol/L的Marimastat以及相同濃度DAPT處理,對照組不進行任何處理,經(jīng)過Transwell侵襲小室實驗,在400倍光學(xué)顯微鏡下隨機5個視野觀察穿過聚碳酸酯膜細胞的個數(shù), 以均數(shù)±標準差(x±σ)表示。2.6流式細胞術(shù)AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測兩類抑制劑對786-0細胞凋亡率的影響我們將腎癌786-0細胞用1μmol/L,3μmol/L的Marimastat與DAPT進行處理,應(yīng)用同體積的DMSO (15μ1)作為對照組,進行Annexin Ⅴ-PI染色后,流式細胞儀檢測經(jīng)不同濃度Marimastat以及DAPT處理后的786-0細胞凋亡率變化。結(jié)果判讀：Modfit軟件分析中我們?nèi)2+Q4象限被染為紅色的細胞比例之和作為細胞凋亡率指標。以上同等條件下重復(fù)試驗3次。2.7統(tǒng)計分析所有指標進行統(tǒng)計學(xué)處理,采用SPSS17.0軟件(SPSS Inc. Chicago, IL,美國)統(tǒng)計軟件進行分析,計量數(shù)值以x±s表示,根據(jù)需要選用配對資料的t檢驗或ANOVA方差分析進行統(tǒng)計分析,選用雙側(cè)檢驗。計數(shù)資料相關(guān)性檢測采用χ2檢驗以及一元性線性回歸分析,取P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果：1.ADAM-17在腎癌組織中的表達全部67例不同分期腎細胞癌組織及正常腎組織均完成正常免疫組化程序,我們通過免疫組化染色的方法發(fā)現(xiàn),在不同TNM分期腎癌組織中,ADAM-17呈高表達,全部67例中陽性表達為43例,占64.18%,而ADAM-17陰性表達者僅有24例,占35.82%,通過對上述計數(shù)資料進行統(tǒng)計學(xué)分析,我們得到,在腎癌組織中,ADAM-17陽性表達比例增多,差距有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=16.39 P0.01)。在留取的10例腎癌旁正常的腎臟組織中,ADAM-17無一例呈表達。在Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期與Ⅳ期ADAM-17陽性表達的腎癌中,進行Western blot檢測,其相對光密度值分別為Ⅰ期腎癌(0.67±0.11)、Ⅱ期腎癌(0.73±0.31)、Ⅲ期腎癌(0.79±0.25)與Ⅳ期腎癌(0.89±0.09)。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析,我們可知在ADAM-17陽性表達的腎癌組織中,隨著腎癌分期的增加,ADAM-17表達亦相應(yīng)增加(t=18.74 P0.01),且在Ⅳ期腎癌中的表達有著顯著的增加(0.89±0.09vs 0.79±0.25)。在流式細胞術(shù)分析腎癌細胞周期中我們發(fā)現(xiàn)無論Ⅲ期與Ⅳ期ADAM-17陽性表達或陰性表達腎細胞癌,細胞周期處于G2期的比例均較高,為0.31 vs 0.22,說明高分期腎癌處于核分裂活躍時期,其惡性程度高；與此同時,我們比較兩組G2期細胞周期數(shù)據(jù),ADAM-17陽性表達的腎癌組織對細胞周期G2期比例有著明顯上調(diào),于ADAM-17陰性表達的腎癌組織相比,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=20.76 P0.01)。2.抑制ADAM-17對腎癌Notch通路調(diào)控特異性的研究我們發(fā)現(xiàn)于無論經(jīng)過Marimastat或者DAPT處理的兩類細胞,其Notch1、Hes-1蛋白表達均明顯下降(P0.05),但是,經(jīng)Marimastat處理的786-0細胞,比較經(jīng)過各濃度DAPT處理后Notchl蛋白、Hes-1蛋白下降更為顯著；在OS-RC-2細胞中,也得到了相似的結(jié)果,我們認為,經(jīng)過Marimastat處理后,腎癌細胞Notch1、Hes-1蛋白的下降程度,相比經(jīng)DAPT處理后的下降程度要更大(786-0 P0.05, OS-RC-2 P0.05)。并且,在相同濃度(1-4μmol/L)下,經(jīng)過Marimastat處理的兩類細胞兩種蛋白濃度比較經(jīng)過DAPT處理的下降程度更大,差距有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05 P005)。我們在cck-8實驗中發(fā)現(xiàn)兩類細胞經(jīng)過上述兩種抑制劑處理后,其OD值均有明顯下降,與此同時我們發(fā)現(xiàn),在相同劑量下,經(jīng)過Marimastat處理的786-0細胞相較于DAPT處理的細胞,OD值下降程度的更小,而相同的情況也出現(xiàn)在OS-RC-2細胞里,且經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析,差異與計量呈相關(guān)性(r=0.991, P0.05, r=0.991, P0.05)。在Transwell侵襲小室實驗中,我們將786-0下?lián)芙?jīng)過兩類抑制劑處理后,與對照組相比,能夠穿過聚碳酸酯膜的細胞個數(shù)均有顯著下降,但是,同樣濃度下經(jīng)Marimastat處理的786-0細胞穿過的數(shù)量更少,,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。應(yīng)用流式細胞術(shù)觀察細胞凋亡率,經(jīng)過DAPT處理后786-0細胞凋亡率為3.4%,5.4%,經(jīng)過Marimastat處理786-0細胞凋亡率為4.5%7.7%；對照組2.8%。經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析,經(jīng)過相同濃度Marimastat處理后的786-0細胞的凋亡率要明顯高于經(jīng)過DAPT處理的兩類細胞,二者相差有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論：1、ADAM-17在腎癌組織中呈高表達,ADAM-17陽性表達隨腫瘤分期的增加其表達相應(yīng)增加2、對于高分期腎細胞癌,ADAM-17的陽性表達能上調(diào)腎癌細胞增殖,進而影響腎癌的侵襲及發(fā)展3、抑制ADAM-17表達可能成為腎癌靶向治療的新位點4、Marimastat以及DAPT均可以降低Notch1蛋白以及Hes-1蛋白的表達,降低786-0細胞以及OS-RC-2細胞的增殖能力,在786-0細胞中可以降低癌細胞侵襲性以及提高其凋亡率5、Marimastat對于兩類細胞Notch通路、細胞侵襲性以及細胞周期及凋亡率的影響比DAPT要更為顯著,Marimastat對于腎癌細胞Notch通路影響以及腎癌發(fā)生發(fā)展的過程具有更好的特異性。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.11

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 周恩昆;陳默;方廖瓊;;Notch信號通路與乳腺腫瘤發(fā)生關(guān)系的研究進展[J];中華腫瘤防治雜志;2008年10期

2 楊雯靖;張雪鵬;焦桂梅;趙光明;路延芹;胡寶山;;ADAM17-siRNA抑制人MCF-7乳腺癌細胞體外侵襲能力的研究[J];天津醫(yī)藥;2011年11期

3 宋應(yīng)健;王立新;洪永青;孟自力;高新懷;;比阿培南治療下呼吸道銅綠假單胞菌感染的療效[J];中華醫(yī)院感染學(xué)雜志;2011年21期

4 ;ADAM17 mRNA expression and pathological features of hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2004年18期

本文編號：2789412