發(fā)布時間：2020-08-11 18:09

【摘要】：胃癌(Gastric cancer,GC)是最常見的消化道腫瘤,全球每年新發(fā)胃癌病例約95.1萬例,死亡72.3萬,發(fā)病率和死亡率居高不下,是威脅人類健康的重大疾病。我國由于存在食用腌制食品的習慣及人群普遍的幽門螺旋桿菌感染,胃癌的發(fā)病率相當高。每年的新發(fā)病例約占全球新發(fā)病例的一半,且大多數(shù)患者就診時已經(jīng)處于中晚期。盡管存在以手術(shù)和藥物化療為主的綜合治療方式,但胃癌的治療卻常因腫瘤轉(zhuǎn)移和復發(fā)而失敗。近年來,分子靶向治療已逐漸成為治療胃癌的有效手段,展示出了巨大的潛力。尋找靈敏的早期篩查標志物及有效的分子治療靶點對胃癌的早期診斷和治療具有相當大的臨床意義。Sox 是一類性別決定基因(Sex determination region of Y chomosome,SRY),參與了人體胚胎發(fā)育、軟骨形成、性別決定等生理過程,某些SOX家族成員還參與了癌癥的進展。Sox4是Sox家族成員之一,在乳腺癌、結(jié)腸癌等腫瘤中扮演著原癌基因的角色。研究報道Sox4還在胃癌組織中高表達且提示患者預后不佳,那么Sox4究竟是通過何種機制在胃癌進展中扮演原癌基因的角色呢?這一點值得我們進一步研究。考慮到上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)與干細胞特性在腫瘤轉(zhuǎn)移和復發(fā)過程中的關(guān)鍵作用,本研究在既往現(xiàn)象研究的基礎(chǔ)上進一步從EMT及干細胞特性的角度出發(fā)探索Sox4在胃癌進展中所起的作用,以期望為胃癌的早期診斷和預后判斷提供新的Marker,為開發(fā)胃癌治療的藥物提供新的靶點。為此,我們進行了以下研究:第一部分胃癌中Sox4的表達及臨床意義目的:探索Sox4在胃癌中的表達模式及與患者預后之間的關(guān)系,探討Sox4與胃癌間質(zhì)化表型及干細胞表型的關(guān)系。方法:免疫組化檢測84對胃癌組織與癌旁組織中Sox4及EMT、干性標志物的表達,利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析Sox4與胃癌患者總生存時間(Overall survival,OS)和無進展生存時間(Progression-free survival,PFS)的關(guān)系。實時熒光定量 PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)檢測 30 例胃癌患者癌組織中Sox4、EMT及干性標志物的表達水平,利用直線相關(guān)模型分析了 Sox4與它們的相關(guān)性。結(jié)果:胃癌組織中Sox4的陽性染色率(65/84 vs 19/84)及染色評分(4.48 vs 2.25)均明顯高于癌旁組織。Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫納入了 593例胃癌患者,生存分析表明Sox4高表達患者比低表達患者擁有更短的總生存時間和無進展生存時間。與Sox4低表達的胃癌患者相比,Sox4高表達患者的癌組織中上皮分子E-cadherin陽性表達率更低((20/65 vs 14/19),而間質(zhì)分子 Vimentin(46/65 vs 6/19)及干性標志分子EpCAM表達率更高(40/65 vs 6/19)。進一步的qRT-PCR及相關(guān)性分析結(jié)果表明Sox4的表達與E-cadherin呈負相關(guān)(r=-0.384)而與Vimentin 及 EpCAM 呈正相關(guān)(r=0.674、0.433)。結(jié)論:Sox4在胃癌組織中表達上調(diào),高表達的Sox4提示患者預后不良。Sox4導致胃癌患者預后不良可能與胃癌細胞的間質(zhì)化表型和干細胞特性獲取有關(guān)。第二部分Sox4促進胃癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及干細胞特性的研究目的:明確Sox4是否促進胃癌細胞的EMT和干細胞特性及并探討相關(guān)機制。方法:(1)構(gòu)建過表達慢病毒載體,轉(zhuǎn)染Sox4內(nèi)源性低表達的胃癌MKN28細胞株。構(gòu)建沉默慢病毒載體,轉(zhuǎn)染Sox4內(nèi)源性高表達的胃癌BGC823細胞株。Transwell實驗檢測Sox4過表達和沉默前后細胞的遷移能力變化,qRT-PCR,Western blot及免疫熒光檢測EMT分子的表達變化。懸浮成球?qū)嶒炗^察Sox4過表達和沉默前后細胞的胃癌細胞自我更新能力的變化,并利用流式細胞儀檢測CD44+/EpCAM+胃癌細胞的比例。(2)qRT-PCR及Western blot檢測Sox4過表達和沉默前后細胞,EMT轉(zhuǎn)錄因子Twist1、Zeb1、Snai11、Snai12及干性轉(zhuǎn)錄因子Sox2、Oct4、Nanog的表達變化。Western blot及免疫熒光檢測β-catenin的表達水平和定位情況。(3)構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型,在體內(nèi)觀察Sox4對胃癌細胞致瘤能力的影響。構(gòu)建裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型,在體內(nèi)觀察Sox4對胃癌細胞轉(zhuǎn)移能力的影響。結(jié)果:(1)過表達Sox4后,MKN28細胞遷移能力增強伴隨著E-cadherin 的下調(diào),N-cadherin 及 Vimentin 的下調(diào)。沉默 Sox4 后,BGC823細胞的遷移能力明顯下降,伴隨著E-cadherin的上調(diào)及Vimentin的下調(diào)。過表達Sox4后,MKN28細胞自我更新能力增強并伴隨著CD44+/EpCAM+胃癌細胞的比例增多,沉默Sox4則在BGC823細胞得到相反的結(jié)果。(2)過表達MKN28細胞的Sox4后,EMT轉(zhuǎn)錄因子Twist1、Zeb1,干性轉(zhuǎn)錄因子Sox2、Oct4的表達上調(diào),β-catenin的總蛋白水平表達上調(diào)并發(fā)生核轉(zhuǎn)位。沉默BGC823細胞的Sox4后,Twist1、Snail1及干性轉(zhuǎn)錄因子Sox2、Oct4的表達下調(diào),β-catenin的總蛋白表達水平表達下調(diào)。(3)過表達Sox4增加了 MKN28細胞的體內(nèi)致瘤能力和肺轉(zhuǎn)移能力,沉默Sox4則降低了 BGC823的體內(nèi)致瘤能力和肺轉(zhuǎn)移能力。結(jié)論:Sox4顯著促進了胃癌細胞發(fā)生EMT并獲取干細胞特性,其機制是上調(diào)了 EMT及干性轉(zhuǎn)錄因子的表達并激活Wnt通路。第三部分Sox4在TGF-β1誘導胃癌細胞惡性行為中的作用研究目的:探討Sox4在TGF-β1促胃癌細胞EMT及干性獲取中的作用。方法:利用 TGF-β1 誘導 MKN28 細胞,qRT-PCR 及 Western blot檢測p-Smad2、Sox4的表達變化。利用TGF-β1誘導BGC823對照組和沉默組細胞,Transwell法檢測細胞轉(zhuǎn)移能力變化,懸浮成球法檢測細胞自我更新能力變化。qRT-PCR及Western blot檢測EMT及干性標志分子的表達變化。結(jié)果:TGF-β1誘導成功激活了胃癌細胞的TGF-β通路,并上調(diào)胃癌細胞Sox4的表達水平。沉默Sox4能夠部分逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導的EMT及干細胞特征,逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導的E-cadherin的下調(diào)和Vimentin的上調(diào)。結(jié)論:Sox4介導了 TGF-β通路誘導的胃癌細胞惡性行為。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.2
【圖文】：

逡逑中Ｓｏｘ４的平均染色強度也明顯高于癌旁組織（圖１．２）。不論是在胃癌組織還是癌逡逑旁組織中，Ｓｏｘ４陽性染色均主要位于細胞核和細胞團，二者并無顯著差異。逡逑邐＊＊邐逡逑１５－１邐１邐Ｉ邐２０－逡逑■邋５邐▲邐Ｉ邋°－邐－－■■■■ＩＩ逡逑0邐ａ：逡逑ｏ－ｉ邐＜邐，邐邋－１０」邐１逡逑Ｃａｎｃｅｒ邐Ｎｏｒｍａｌ邐Ｃａｎｃｅｒ邋ｖｓ邋Ｎｏｒｍａｌ逡逑圖１．１邋Ｓｏｘ４基因在胃癌及癌旁組織中的表達情況。ｑＲＴ－ＰＣＲ檢測３０對胃癌及癌旁組織中逡逑Ｓｏｘ４的ｍＲＮＡ表達水平，ＡＣＴ越高表達越低（左）。以癌組織Ｓｏｘ４的ｍＲＮＡ水平比上癌逡逑旁組織的ｍＲＮＡ水平得到相對表達倍數(shù)即２－△厶ＣＴ值（右）。逡逑Ｆｉｇ．１．１邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｓｏｘ４邋ｍＲＮＡ邋ｉｎ邋ＧＣ邋ａｎｄ邋ａｄｊａｃｅｎｔ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ｏｆ邋３０邋ｐａｔｉｅｎｔｓ邋ｗｉｔｈ邋ＧＣ．逡逑Ｈｉｇｈｅｒ邋ＡＣＴ邋ｖａｌｕｅｓ邋ｉｎｄｉｃａｔｅ邋ｌｏｗｅｒ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋（ｌｅｆｔ）．邋Ｔｈｅ邋ｒａｔｉｏ邋ｏｆ邋Ｓｏｘ４邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｉｎ邋ｃａｎｃｅｒ邋ｔｏ逡逑ａｄｊａｃｅｎｔ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ｉｓ邋ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋ａｓ邋２－ＡＡＣＴ邋（ｒｉｇｈ

逡逑中Ｓｏｘ４的平均染色強度也明顯高于癌旁組織（圖１．２）。不論是在胃癌組織還是癌逡逑旁組織中，Ｓｏｘ４陽性染色均主要位于細胞核和細胞團，二者并無顯著差異。逡逑邐＊＊邐逡逑１５－１邐１邐Ｉ邐２０－逡逑■邋５邐▲邐Ｉ邋°－邐－－■■■■ＩＩ逡逑0邐ａ：逡逑ｏ－ｉ邐＜邐，邐邋－１０」邐１逡逑Ｃａｎｃｅｒ邐Ｎｏｒｍａｌ邐Ｃａｎｃｅｒ邋ｖｓ邋Ｎｏｒｍａｌ逡逑圖１．１邋Ｓｏｘ４基因在胃癌及癌旁組織中的表達情況。ｑＲＴ－ＰＣＲ檢測３０對胃癌及癌旁組織中逡逑Ｓｏｘ４的ｍＲＮＡ表達水平，ＡＣＴ越高表達越低（左）。以癌組織Ｓｏｘ４的ｍＲＮＡ水平比上癌逡逑旁組織的ｍＲＮＡ水平得到相對表達倍數(shù)即２－△厶ＣＴ值（右）。逡逑Ｆｉｇ．１．１邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｓｏｘ４邋ｍＲＮＡ邋ｉｎ邋ＧＣ邋ａｎｄ邋ａｄｊａｃｅｎｔ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ｏｆ邋３０邋ｐａｔｉｅｎｔｓ邋ｗｉｔｈ邋ＧＣ．逡逑Ｈｉｇｈｅｒ邋ＡＣＴ邋ｖａｌｕｅｓ邋ｉｎｄｉｃａｔｅ邋ｌｏｗｅｒ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋（ｌｅｆｔ）．邋Ｔｈｅ邋ｒａｔｉｏ邋ｏｆ邋Ｓｏｘ４邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｉｎ邋ｃａｎｃｅｒ邋ｔｏ逡逑ａｄｊａｃｅｎｔ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ｉｓ邋ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋ａｓ邋２－ＡＡＣＴ邋（ｒｉｇｈ

ｉｌｌ邋ｉ逡逑Ｇａｎｃｓｒ邐Ｍｏｎ－ｃ３ｎｃ６ｒ逡逑圖１．２邋Ｓ0Ｘ４蛋白在胃癌及癌旁組織中的表達情況。Ａ．代表性的Ｓｏｘ４免疫組化染色圖片（ｘ逡逑４００）邋；Ｂ．胃癌和癌旁組織中Ｓｏｘ４的平均染色評分。逡逑Ｆｉｇ．１．２邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｓｏｘ４邋ｐｒｏｔｉｅｎ邋ｉｎ邋ｃａｎｃｅｒ邋ａｎｄ邋ａｄｊａｃｅｎｔ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ｏｆ邋８４邋ｐａｔｉｅｎｔｓ邋ｗｉｔｈ逡逑ＧＣ．邋Ａ．邋Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ邋Ｓｏｘ４邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｉｎ邋ＧＣ邋ａｎｄ邋ｍａｔｃｈｅｄ邋ｎｏｎｃａｎｃｅｒ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ｏｆ邋８邋ｔｙｐｉｃａｌ邋ｐａｔｉｅｎｔｓ逡逑ｂｙ邋ＩＨＣ．邋Ｂ．邋Ｔｈｅ邋ｍｅａｎ邋ｓｃｏｒｅ邋ｆｏｒ邋ａｌｌ邋ＧＣ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ａｎｄ邋ｍａｔｃｈｅｄ邋ｎｏｎ－ｃａｎｃｅｒ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ｗｅｒｅ邋ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ．逡逑Ｔｈｅ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｗｅｒｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋ａｓ邋ｍｅａｎ邋士邋ＳＤ邋ａｎｄ邋ｗｅｒｅ邋ａｎａｌｙｚｅｄ邋ｂｙ邋ｔｈｅ邋ｔｗｏ－ｓａｍｐｌｅ邋ｔ－ｔｅｓｔ．邋＊＊Ｐ邋＜逡逑０．０１．逡逑２．２邋Ｓｏｘ４的表達與胃癌患者預后之間的關(guān)系逡逑Ｃｈｉａ－Ｌａｎｇ邋Ｆａｎｇ等人的研究表明Ｓｏｘ４高表達的患者具有更短的總生存期，這逡逑提示Ｓｏｘ４作為一個原癌基因?qū)е挛赴┗颊哳A后不良。考慮到Ｃｈｉａ－Ｌａｎｇ邋Ｆａｎｇ只納逡逑入了邋１６８位患者且只探討了細胞核Ｓｏｘ４與患者預后的關(guān)系，我們有必要擴大樣本逡逑量對結(jié)果進行進一步驗證。為此

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

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本文編號：2789394