【摘要】：胃癌(Gastric cancer,GC)是最常見的消化道腫瘤,全球每年新發(fā)胃癌病例約95.1萬例,死亡72.3萬,發(fā)病率和死亡率居高不下,是威脅人類健康的重大疾病。我國由于存在食用腌制食品的習(xí)慣及人群普遍的幽門螺旋桿菌感染,胃癌的發(fā)病率相當(dāng)高。每年的新發(fā)病例約占全球新發(fā)病例的一半,且大多數(shù)患者就診時(shí)已經(jīng)處于中晚期。盡管存在以手術(shù)和藥物化療為主的綜合治療方式,但胃癌的治療卻常因腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)而失敗。近年來,分子靶向治療已逐漸成為治療胃癌的有效手段,展示出了巨大的潛力。尋找靈敏的早期篩查標(biāo)志物及有效的分子治療靶點(diǎn)對(duì)胃癌的早期診斷和治療具有相當(dāng)大的臨床意義。Sox 是一類性別決定基因(Sex determination region of Y chomosome,SRY),參與了人體胚胎發(fā)育、軟骨形成、性別決定等生理過程,某些SOX家族成員還參與了癌癥的進(jìn)展。Sox4是Sox家族成員之一,在乳腺癌、結(jié)腸癌等腫瘤中扮演著原癌基因的角色。研究報(bào)道Sox4還在胃癌組織中高表達(dá)且提示患者預(yù)后不佳,那么Sox4究竟是通過何種機(jī)制在胃癌進(jìn)展中扮演原癌基因的角色呢?這一點(diǎn)值得我們進(jìn)一步研究�？紤]到上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)與干細(xì)胞特性在腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)過程中的關(guān)鍵作用,本研究在既往現(xiàn)象研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步從EMT及干細(xì)胞特性的角度出發(fā)探索Sox4在胃癌進(jìn)展中所起的作用,以期望為胃癌的早期診斷和預(yù)后判斷提供新的Marker,為開發(fā)胃癌治療的藥物提供新的靶點(diǎn)。為此,我們進(jìn)行了以下研究:第一部分胃癌中Sox4的表達(dá)及臨床意義目的:探索Sox4在胃癌中的表達(dá)模式及與患者預(yù)后之間的關(guān)系,探討Sox4與胃癌間質(zhì)化表型及干細(xì)胞表型的關(guān)系。方法:免疫組化檢測(cè)84對(duì)胃癌組織與癌旁組織中Sox4及EMT、干性標(biāo)志物的表達(dá),利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析Sox4與胃癌患者總生存時(shí)間(Overall survival,OS)和無進(jìn)展生存時(shí)間(Progression-free survival,PFS)的關(guān)系。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)檢測(cè) 30 例胃癌患者癌組織中Sox4、EMT及干性標(biāo)志物的表達(dá)水平,利用直線相關(guān)模型分析了 Sox4與它們的相關(guān)性。結(jié)果:胃癌組織中Sox4的陽性染色率(65/84 vs 19/84)及染色評(píng)分(4.48 vs 2.25)均明顯高于癌旁組織。Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫納入了 593例胃癌患者,生存分析表明Sox4高表達(dá)患者比低表達(dá)患者擁有更短的總生存時(shí)間和無進(jìn)展生存時(shí)間。與Sox4低表達(dá)的胃癌患者相比,Sox4高表達(dá)患者的癌組織中上皮分子E-cadherin陽性表達(dá)率更低((20/65 vs 14/19),而間質(zhì)分子 Vimentin(46/65 vs 6/19)及干性標(biāo)志分子EpCAM表達(dá)率更高(40/65 vs 6/19)。進(jìn)一步的qRT-PCR及相關(guān)性分析結(jié)果表明Sox4的表達(dá)與E-cadherin呈負(fù)相關(guān)(r=-0.384)而與Vimentin 及 EpCAM 呈正相關(guān)(r=0.674、0.433)。結(jié)論:Sox4在胃癌組織中表達(dá)上調(diào),高表達(dá)的Sox4提示患者預(yù)后不良。Sox4導(dǎo)致胃癌患者預(yù)后不良可能與胃癌細(xì)胞的間質(zhì)化表型和干細(xì)胞特性獲取有關(guān)。第二部分Sox4促進(jìn)胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及干細(xì)胞特性的研究目的:明確Sox4是否促進(jìn)胃癌細(xì)胞的EMT和干細(xì)胞特性及并探討相關(guān)機(jī)制。方法:(1)構(gòu)建過表達(dá)慢病毒載體,轉(zhuǎn)染Sox4內(nèi)源性低表達(dá)的胃癌MKN28細(xì)胞株。構(gòu)建沉默慢病毒載體,轉(zhuǎn)染Sox4內(nèi)源性高表達(dá)的胃癌BGC823細(xì)胞株。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Sox4過表達(dá)和沉默前后細(xì)胞的遷移能力變化,qRT-PCR,Western blot及免疫熒光檢測(cè)EMT分子的表達(dá)變化。懸浮成球?qū)嶒?yàn)觀察Sox4過表達(dá)和沉默前后細(xì)胞的胃癌細(xì)胞自我更新能力的變化,并利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD44+/EpCAM+胃癌細(xì)胞的比例。(2)qRT-PCR及Western blot檢測(cè)Sox4過表達(dá)和沉默前后細(xì)胞,EMT轉(zhuǎn)錄因子Twist1、Zeb1、Snai11、Snai12及干性轉(zhuǎn)錄因子Sox2、Oct4、Nanog的表達(dá)變化。Western blot及免疫熒光檢測(cè)β-catenin的表達(dá)水平和定位情況。(3)構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型,在體內(nèi)觀察Sox4對(duì)胃癌細(xì)胞致瘤能力的影響。構(gòu)建裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型,在體內(nèi)觀察Sox4對(duì)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響。結(jié)果:(1)過表達(dá)Sox4后,MKN28細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)伴隨著E-cadherin 的下調(diào),N-cadherin 及 Vimentin 的下調(diào)。沉默 Sox4 后,BGC823細(xì)胞的遷移能力明顯下降,伴隨著E-cadherin的上調(diào)及Vimentin的下調(diào)。過表達(dá)Sox4后,MKN28細(xì)胞自我更新能力增強(qiáng)并伴隨著CD44+/EpCAM+胃癌細(xì)胞的比例增多,沉默Sox4則在BGC823細(xì)胞得到相反的結(jié)果。(2)過表達(dá)MKN28細(xì)胞的Sox4后,EMT轉(zhuǎn)錄因子Twist1、Zeb1,干性轉(zhuǎn)錄因子Sox2、Oct4的表達(dá)上調(diào),β-catenin的總蛋白水平表達(dá)上調(diào)并發(fā)生核轉(zhuǎn)位。沉默BGC823細(xì)胞的Sox4后,Twist1、Snail1及干性轉(zhuǎn)錄因子Sox2、Oct4的表達(dá)下調(diào),β-catenin的總蛋白表達(dá)水平表達(dá)下調(diào)。(3)過表達(dá)Sox4增加了 MKN28細(xì)胞的體內(nèi)致瘤能力和肺轉(zhuǎn)移能力,沉默Sox4則降低了 BGC823的體內(nèi)致瘤能力和肺轉(zhuǎn)移能力。結(jié)論:Sox4顯著促進(jìn)了胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT并獲取干細(xì)胞特性,其機(jī)制是上調(diào)了 EMT及干性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)并激活Wnt通路。第三部分Sox4在TGF-β1誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞惡性行為中的作用研究目的:探討Sox4在TGF-β1促胃癌細(xì)胞EMT及干性獲取中的作用。方法:利用 TGF-β1 誘導(dǎo) MKN28 細(xì)胞,qRT-PCR 及 Western blot檢測(cè)p-Smad2、Sox4的表達(dá)變化。利用TGF-β1誘導(dǎo)BGC823對(duì)照組和沉默組細(xì)胞,Transwell法檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力變化,懸浮成球法檢測(cè)細(xì)胞自我更新能力變化。qRT-PCR及Western blot檢測(cè)EMT及干性標(biāo)志分子的表達(dá)變化。結(jié)果:TGF-β1誘導(dǎo)成功激活了胃癌細(xì)胞的TGF-β通路,并上調(diào)胃癌細(xì)胞Sox4的表達(dá)水平。沉默Sox4能夠部分逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的EMT及干細(xì)胞特征,逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的E-cadherin的下調(diào)和Vimentin的上調(diào)。結(jié)論:Sox4介導(dǎo)了 TGF-β通路誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞惡性行為。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.2
【圖文】：

逡逑中Ｓｏｘ４的平均染色強(qiáng)度也明顯高于癌旁組織（圖１．２）。不論是在胃癌組織還是癌逡逑旁組織中，Ｓｏｘ４陽性染色均主要位于細(xì)胞核和細(xì)胞團(tuán)，二者并無顯著差異。逡逑邐＊＊邐逡逑１５－１邐１邐Ｉ邐２０－逡逑■邋５邐▲邐Ｉ邋°－邐－－■■■■ＩＩ逡逑0邐ａ：逡逑ｏ－ｉ邐＜邐，邐邋－１０」邐１逡逑Ｃａｎｃｅｒ邐Ｎｏｒｍａｌ邐Ｃａｎｃｅｒ邋ｖｓ邋Ｎｏｒｍａｌ逡逑圖１．１邋Ｓｏｘ４基因在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)情況。ｑＲＴ－ＰＣＲ檢測(cè)３０對(duì)胃癌及癌旁組織中逡逑Ｓｏｘ４的ｍＲＮＡ表達(dá)水平，ＡＣＴ越高表達(dá)越低（左）。以癌組織Ｓｏｘ４的ｍＲＮＡ水平比上癌逡逑旁組織的ｍＲＮＡ水平得到相對(duì)表達(dá)倍數(shù)即２－△厶ＣＴ值（右）。逡逑Ｆｉｇ．１．１邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｓｏｘ４邋ｍＲＮＡ邋ｉｎ邋ＧＣ邋ａｎｄ邋ａｄｊａｃｅｎｔ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ｏｆ邋３０邋ｐａｔｉｅｎｔｓ邋ｗｉｔｈ邋ＧＣ．逡逑Ｈｉｇｈｅｒ邋ＡＣＴ邋ｖａｌｕｅｓ邋ｉｎｄｉｃａｔｅ邋ｌｏｗｅｒ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋（ｌｅｆｔ）．邋Ｔｈｅ邋ｒａｔｉｏ邋ｏｆ邋Ｓｏｘ４邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｉｎ邋ｃａｎｃｅｒ邋ｔｏ逡逑ａｄｊａｃｅｎｔ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ｉｓ邋ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋ａｓ邋２－ＡＡＣＴ邋（ｒｉｇｈ

逡逑中Ｓｏｘ４的平均染色強(qiáng)度也明顯高于癌旁組織（圖１．２）。不論是在胃癌組織還是癌逡逑旁組織中，Ｓｏｘ４陽性染色均主要位于細(xì)胞核和細(xì)胞團(tuán)，二者并無顯著差異。逡逑邐＊＊邐逡逑１５－１邐１邐Ｉ邐２０－逡逑■邋５邐▲邐Ｉ邋°－邐－－■■■■ＩＩ逡逑0邐ａ：逡逑ｏ－ｉ邐＜邐，邐邋－１０」邐１逡逑Ｃａｎｃｅｒ邐Ｎｏｒｍａｌ邐Ｃａｎｃｅｒ邋ｖｓ邋Ｎｏｒｍａｌ逡逑圖１．１邋Ｓｏｘ４基因在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)情況。ｑＲＴ－ＰＣＲ檢測(cè)３０對(duì)胃癌及癌旁組織中逡逑Ｓｏｘ４的ｍＲＮＡ表達(dá)水平，ＡＣＴ越高表達(dá)越低（左）。以癌組織Ｓｏｘ４的ｍＲＮＡ水平比上癌逡逑旁組織的ｍＲＮＡ水平得到相對(duì)表達(dá)倍數(shù)即２－△厶ＣＴ值（右）。逡逑Ｆｉｇ．１．１邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｓｏｘ４邋ｍＲＮＡ邋ｉｎ邋ＧＣ邋ａｎｄ邋ａｄｊａｃｅｎｔ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ｏｆ邋３０邋ｐａｔｉｅｎｔｓ邋ｗｉｔｈ邋ＧＣ．逡逑Ｈｉｇｈｅｒ邋ＡＣＴ邋ｖａｌｕｅｓ邋ｉｎｄｉｃａｔｅ邋ｌｏｗｅｒ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋（ｌｅｆｔ）．邋Ｔｈｅ邋ｒａｔｉｏ邋ｏｆ邋Ｓｏｘ４邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｉｎ邋ｃａｎｃｅｒ邋ｔｏ逡逑ａｄｊａｃｅｎｔ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ｉｓ邋ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋ａｓ邋２－ＡＡＣＴ邋（ｒｉｇｈ

ｉｌｌ邋ｉ逡逑Ｇａｎｃｓｒ邐Ｍｏｎ－ｃ３ｎｃ６ｒ逡逑圖１．２邋Ｓ0Ｘ４蛋白在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)情況。Ａ．代表性的Ｓｏｘ４免疫組化染色圖片（ｘ逡逑４００）邋；Ｂ．胃癌和癌旁組織中Ｓｏｘ４的平均染色評(píng)分。逡逑Ｆｉｇ．１．２邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｓｏｘ４邋ｐｒｏｔｉｅｎ邋ｉｎ邋ｃａｎｃｅｒ邋ａｎｄ邋ａｄｊａｃｅｎｔ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ｏｆ邋８４邋ｐａｔｉｅｎｔｓ邋ｗｉｔｈ逡逑ＧＣ．邋Ａ．邋Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ邋Ｓｏｘ４邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｉｎ邋ＧＣ邋ａｎｄ邋ｍａｔｃｈｅｄ邋ｎｏｎｃａｎｃｅｒ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ｏｆ邋８邋ｔｙｐｉｃａｌ邋ｐａｔｉｅｎｔｓ逡逑ｂｙ邋ＩＨＣ．邋Ｂ．邋Ｔｈｅ邋ｍｅａｎ邋ｓｃｏｒｅ邋ｆｏｒ邋ａｌｌ邋ＧＣ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ａｎｄ邋ｍａｔｃｈｅｄ邋ｎｏｎ－ｃａｎｃｅｒ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ｗｅｒｅ邋ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ．逡逑Ｔｈｅ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｗｅｒｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋ａｓ邋ｍｅａｎ邋士邋ＳＤ邋ａｎｄ邋ｗｅｒｅ邋ａｎａｌｙｚｅｄ邋ｂｙ邋ｔｈｅ邋ｔｗｏ－ｓａｍｐｌｅ邋ｔ－ｔｅｓｔ．邋＊＊Ｐ邋＜逡逑０．０１．逡逑２．２邋Ｓｏｘ４的表達(dá)與胃癌患者預(yù)后之間的關(guān)系逡逑Ｃｈｉａ－Ｌａｎｇ邋Ｆａｎｇ等人的研究表明Ｓｏｘ４高表達(dá)的患者具有更短的總生存期，這逡逑提示Ｓｏｘ４作為一個(gè)原癌基因?qū)е挛赴┗颊哳A(yù)后不良。考慮到Ｃｈｉａ－Ｌａｎｇ邋Ｆａｎｇ只納逡逑入了邋１６８位患者且只探討了細(xì)胞核Ｓｏｘ４與患者預(yù)后的關(guān)系，我們有必要擴(kuò)大樣本逡逑量對(duì)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。為此

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

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本文編號(hào)：2789394