發(fā)布時間：2020-08-08 15:45

【摘要】：目的:探索m6A去甲基化酶ALKBH5在胰腺癌組織中的表達(dá),及其與胰腺癌病理分級、臨床分期和預(yù)后的相關(guān)性。方法:(1)采用免疫組化方法檢測90對胰腺癌/正常胰腺的組織芯片中ALKBH5表達(dá)情況,分析ALKBH5表達(dá)與病理分級,臨床分期和疾病預(yù)后的關(guān)系。(2)下載TCGA數(shù)據(jù)庫中183例胰腺癌病例數(shù)據(jù),分析ALKBH5在胰腺癌中的表達(dá)情況,分析ALKBH5表達(dá)與病理分級,臨床分期和疾病預(yù)后的關(guān)系。(3)運(yùn)用RT-PCR和Western-Blot方法檢測ALKBH5在新鮮胰腺癌組織/正常胰腺組織中的表達(dá)情況。結(jié)果:(1)組織芯片免疫組化的結(jié)果顯示,90例胰腺癌病例中ALKBH5的表達(dá)水平:62.2%(56/90)癌組織正常胰腺組織,22.2%(20/90)癌組織與正常胰腺組織中的表達(dá)量相當(dāng),僅15.6%(14/90)癌組織正常胰腺組織。統(tǒng)計分析示ALKBH5在癌組織中的表達(dá)量低于正常胰腺組織,p0.0001;分析TCGA數(shù)據(jù),KRAS、CDKN2A、TP53或SMAD4等基因突變組中,ALKBH5的表達(dá)明顯較未突變組低,且差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。WB檢測結(jié)果顯示:ALKBH5蛋白表達(dá)水平:癌組織正常胰腺組織,P0.05;RT-PCR檢測結(jié)果顯示:ALKBH5 m RNA表達(dá)水平:癌組織正常胰腺組織,P0.05。(2)根據(jù)AJCC病理分級惡性程度越高的病例,ALKBH5蛋白表達(dá)越低。胰腺癌TNM分期病程越晚期,ALKBH5蛋白表達(dá)越低。高表達(dá)組(N=46)中位生存期為25.5個月,五年生存率為40.5%,而低表達(dá)組(N=44)中位生存期為11個月,五年生存率為11.3%。低表達(dá)組生存期較高表達(dá)組短,P0.05。分析TCGA數(shù)據(jù),結(jié)果示:高表達(dá)組(N=95)中位生存期為23個月,五年生存率為42.5%,低表達(dá)組(N=87)五年生存率為15.7%,中位生存期為18個月,低表達(dá)組生存期較高表達(dá)組短,p0.01。結(jié)論:ALKBH5在胰腺癌中低表達(dá),且其表達(dá)水平與臨床分期、病理分級及預(yù)后等負(fù)相關(guān)。此外,在胰腺癌組織中,胰腺癌發(fā)生關(guān)鍵基因KRAS、CDKN2A、TP53或SMAD4突變后ALKBH5的表達(dá)減少,ALKBH5表達(dá)減少可能與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。目的:探討m6A去甲基化酶ALKBH5對胰腺癌的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。方法:(1)采用si RNA干擾技術(shù)、Crispr/cas9技術(shù)和慢病毒技術(shù)干預(yù)胰腺癌細(xì)胞系中ALKBH5的表達(dá);(2)檢測胰腺癌組織/正常胰腺組織中m RNA的m6A水平,干擾胰腺癌細(xì)胞中ALKBH5表達(dá)后,檢測胰腺癌細(xì)胞m RNA的m6A水平;(3)體外采用CCK-8、克隆平板、劃痕和Transwell等實(shí)驗(yàn)方法檢測ALKBH5對胰腺癌細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響;(4)干預(yù)胰腺癌細(xì)胞中ALKBH5表達(dá)后,采用皮下成瘤模型和胰腺癌原位模型,研究體內(nèi)ALKBH5對胰腺癌細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。結(jié)果:(1)m6A的水平,癌組織癌旁組織,細(xì)胞中,ALKBH5下調(diào)組空白對照組,野生型ALKBH5上調(diào)組空白對照組,上調(diào)突變型ALKBH5(H204A)對m6A水平無影響。(2)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果示,增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力ALKBH5下調(diào)組空白對照組,野生ALKBH5上調(diào)組空白對照組,上調(diào)突變型ALKBH5(H204A)對增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力無影響。(3)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí),Crispr/cas9技術(shù)敲除ALKBH5表達(dá)后,細(xì)胞增殖侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。結(jié)論:ALKBH5在胰腺癌細(xì)胞中發(fā)揮抑癌作用,ALKBH5抑制胰腺癌細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移,且對增殖侵襲轉(zhuǎn)移的影響與其去甲基化酶功能相關(guān)。目的:探討ALKBH5的上下游調(diào)控機(jī)制方法:(1)運(yùn)用Oncomine、Gepia和c Bio Portal等公共數(shù)據(jù)庫,分析TP53與ALKBH5表達(dá)的相關(guān)性;運(yùn)用si RNA干擾、質(zhì)粒過表達(dá)或crispr/cas9系統(tǒng)敲除等方法改變TP53表達(dá)后,研究ALKBH5的表達(dá)情況;構(gòu)建ALKBH5啟動子熒光報告素質(zhì)粒,干擾TP53表達(dá)后,檢測ALKBH5啟動子活性的變化情況。(2)敲減ALKBH5后,進(jìn)行Me RIP-seq和m RNA表達(dá)譜測序,分析Me RIP-seq中ALKBH5下調(diào)組特異peak對應(yīng)的基因,以及m RNA表達(dá)譜測序中下調(diào)基因,尋找ALKBH5下游可能關(guān)鍵基因和通路。(3)運(yùn)用WB、RT-PCR和熒光報告素試驗(yàn),研究ALKBH5對APC/β-catenin/wnt通路的影響。(4)上調(diào)APC表達(dá)后,體外采用CCK-8、劃痕和Tranwell等試驗(yàn),檢測APC對胰腺癌增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。結(jié)果:(1)ALKBH5表達(dá)與野生型TP53表達(dá)正相關(guān)。野生型TP53促進(jìn)ALKBH5的轉(zhuǎn)錄,突變型TP53無此功能。(2)Me RIP-seq結(jié)果:NC組富集到47647個peak,對應(yīng)8147個基因,si ALKBH5組富集到49134個peak,對應(yīng)8434個基因。其中,NC組特有6702個peak,對應(yīng)2631個基因,si ALKBH5組有特有8192個peak對應(yīng)3127個基因。m RNA表達(dá)譜測序結(jié)果:敲減ALKBH5之后,1361個基因改變明顯,其中535個基因上調(diào),826個基因下調(diào)。分析篩選出ALKBH5下游關(guān)鍵基因可能有RHOBTB2、TAF1、KSR1、APC、CDKN1A、WT1、HSF4等。RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示,下調(diào)ALKBH5后APC減少最明顯。(3)下調(diào)ALKBH5之后,APC的m RNA 3’-UTR區(qū)域穩(wěn)定性降低,APC的m RNA及蛋白表達(dá)減少,β-catenin入核增加,TCF4/LEF與靶基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)結(jié)合活性增強(qiáng);上調(diào)野生型ALKBH5表達(dá)之后,APC的m RNA及蛋白表達(dá)增加,β-catenin入核減少,TCF4/LEF與靶基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)結(jié)合活性減弱;過表達(dá)突變型ALKBH5則對APC/wnt/β-catenin/TCF4通路傳導(dǎo)無影響。(4)上調(diào)APC可逆轉(zhuǎn)ALKBH5下調(diào)所致的細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移增強(qiáng)。結(jié)論:胰腺癌中TP53突變導(dǎo)致促進(jìn)ALKBH5轉(zhuǎn)錄的功能喪失,ALKBH5表達(dá)減少。APC/β-catenin/wnt通路增強(qiáng),是ALKBH5低表達(dá)促進(jìn)增殖和侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)鍵機(jī)制,ALKBH5/APC/β-catenin/wnt可能成為胰腺癌新的治療靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.9
【圖文】：

組織芯片結(jié)果顯示 ALKBH5 在胰腺癌中低表達(dá)，與生存預(yù)后臨床指標(biāo)負(fù)我們利用免疫組化檢測胰腺癌組織芯片中 ALKBH5 表達(dá)情況，并結(jié)合臨 ALKBH5 與胰腺癌病理分級、臨床分期、預(yù)后生存的關(guān)系。ALKBH5 中均有分布，表達(dá)強(qiáng)度在 0-2.5 不等（如圖 1.1）。

圖 1.2 組織芯片臨床數(shù)據(jù)分析結(jié)果 A. 潛水圖，表達(dá)值求 log(2,T/NT) B. ALKBH5在癌組織和正常胰腺組織中的表達(dá)情況 C. 病理分級 D.臨床分期 E. 生存期分析。1.4.2 TCGA 數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，ALKBH5 低表達(dá)與 KRAS、CDKN2A、TP53 和SMAD4 等基因突變相關(guān)，且 ALKBH5 低表達(dá)組患者生存期更短。

圖 1.3 TCGA 數(shù)據(jù)中 ALKBH5 表達(dá)與基因突變的關(guān)系 A. 183 例病例中 CDK2A、SMAD4、TP53、KRAS 等基因的突變組和未突變組 ALKBH5 的表達(dá)情況 B.ALKBH5多復(fù)制本組與單復(fù)制本組生存期分析 C.ALKBH5 缺失組與正常表達(dá)組生存期分析

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本文編號：2785767