【摘要】：全國(guó)腫瘤登記中心通過(guò)分析全國(guó)腫瘤發(fā)病與死亡資料,估計(jì)2015年全國(guó)肝癌相關(guān)死亡率在惡性腫瘤相關(guān)的死亡率中排名第3位,發(fā)病率在惡性腫瘤中位于第4位。盡管近年來(lái)醫(yī)學(xué)研究、醫(yī)療設(shè)備和醫(yī)療技術(shù)取得了很大的進(jìn)步,但目前臨床上缺乏治療肝癌的有效方法。多數(shù)肝癌患者晚期會(huì)出現(xiàn)大量惡性腹腔積液(malignant ascites,MA),大量腹腔積液嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量?目前沒(méi)有治療惡性腹腔積液十分有效的方案。目前的研究認(rèn)為血管滲透性增加和新生血管的形成是MA形成的主要機(jī)制。研究者認(rèn)為拮抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、基質(zhì)金屬蛋白酶的作用可以減少M(fèi)A的形成?但這些藥物的臨床療效有限,仍需尋找其他有效的治療手段。肝癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中多條信號(hào)通路起著重要的作用。目前的研究認(rèn)為在肝癌、肺癌、乳腺癌等腫瘤組織和細(xì)胞中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子家族(signal transduction and activators of transcription,STATs)的重要成員STAT3異常表達(dá)和激活,STAT3參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和凋亡過(guò)程。免疫細(xì)胞及免疫因子參與了肝癌發(fā)生、發(fā)展的各個(gè)環(huán)節(jié)。白介素(IL)-9是Th9、Th17等多種免疫細(xì)胞分泌的免疫效應(yīng)因子。IL-9通過(guò)與IL-9受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用。目前的研究發(fā)現(xiàn)IL-9具有多種免疫效用,它即存在促炎作用又存在抗炎作用。但目前IL-9在腫瘤中的研究較少,IL-9與腫瘤的關(guān)系尚未明確。研究發(fā)現(xiàn)使用IL-9干預(yù)黑色素瘤細(xì)胞,可抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。相反的是,在肺癌的研究發(fā)現(xiàn)IL-9能促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖。我們?cè)谇捌诘难芯恐邪l(fā)肝癌并惡性腹腔積液患者M(jìn)A中Th9細(xì)胞比例以及IL-9濃度高于對(duì)應(yīng)外周血水平,也高于肝硬化患者腹水中的水平。且相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)MA中Th9細(xì)胞比例以及IL-9水平與患者的生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。那么Th9/IL-9對(duì)肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為存在怎樣的影響呢?Th9/IL-9是通過(guò)何種機(jī)制對(duì)肝癌細(xì)胞產(chǎn)生影響的呢?Th9/IL-9是否可以作為肝癌惡性腹腔積液干預(yù)治療的靶點(diǎn)呢?為探索上述問(wèn)題我們將從以下兩方面進(jìn)行研究:第一部分白介素-9對(duì)肝癌細(xì)胞的生物學(xué)作用及其機(jī)制研究目的:研究白介素(IL)-9干預(yù)后肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)行為的改變情況,并探索IL-9對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為生產(chǎn)影響的可能機(jī)制。方法:體外培養(yǎng)SMMC-7721細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,將SMMC-7721細(xì)胞分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組分別予12.5 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL的重組人IL-9處理,對(duì)照組不予任何干預(yù)。干預(yù)細(xì)胞24h后,CCK8法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖情況,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力。留取培養(yǎng)基上清ELISA檢測(cè)上清中MMP-2,MMP-9和VEGF水平。提取細(xì)胞RNA后RT-PCR檢測(cè)MMP-2,MMP-9和VEGF mRNA水平。提取細(xì)胞蛋白后Western-blot法檢測(cè)細(xì)胞中JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3表達(dá)水平。在探索IL-9對(duì)SMMC-7721細(xì)胞產(chǎn)生影響的機(jī)制的研究中,實(shí)驗(yàn)組分別予50ng/mL IL-9、50 ng/mL IL-9+40umol/L AG490處理,對(duì)照組不做任何處理。干預(yù)細(xì)胞24h后,CCK8法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖情況;Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力。Western-blot法檢測(cè)細(xì)胞中STAT3和p-STAT3表達(dá)水平,RT-PCR檢測(cè)MMP-2,MMP-9和VEGF mRNA水平。結(jié)果:以12.5 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL濃度的IL-9干預(yù)SMMC-7721細(xì)胞24 h后,SMMC-7721細(xì)胞增殖率明顯上升,與此同時(shí)SMMC-7721細(xì)胞的遷移和侵襲能力亦增加(p0.05),且IL-9對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力的促進(jìn)作用隨著IL-9濃度的增高而增強(qiáng)。但在凋亡實(shí)驗(yàn)中并未發(fā)現(xiàn)IL-9干預(yù)SMMC-7721細(xì)胞后,細(xì)胞的凋亡率發(fā)生明顯改變(p0.05)。對(duì)培養(yǎng)基上清進(jìn)行ELISA檢測(cè)后發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組在IL-9干預(yù)后上清中MMP-2,MMP-9和VEGF水平顯著升高(p0.05)。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果亦顯示,與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在IL-9干預(yù)后細(xì)胞中MMP-2,MMP-9和VEGF mRNA的表達(dá)水平升高(p0.05)。與對(duì)照組比較,IL-9干預(yù)后SMMC-7721細(xì)胞中的JAK2、STAT3蛋白水平無(wú)明顯改變(p0.05),但p-JAK2、p-STAT3表達(dá)水平顯著增高(p0.05)。使用AG490預(yù)處理后,IL-9對(duì)SMMC-7721的增殖和轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用被削弱(p0.05),且p-STAT3、MMP-2,MMP-9和VEGF mRNA的表達(dá)水平亦顯著降低(p0.05)。結(jié)論:IL-9以濃度依賴性促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,但對(duì)細(xì)胞凋亡無(wú)顯著影響。IL-9對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的促進(jìn)作用是通過(guò)激活STAT3磷酸化,促進(jìn)MMP-2,MMP-9和VEGF表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。第二部分抗IL-9抗體對(duì)肝癌惡性腹水抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究目的:檢測(cè)肝癌惡性腹腔積液小鼠模型外周血和惡性腹腔積液中IL-9、IFN-γ濃度,檢測(cè)肝癌惡性腹腔積液小鼠模型脾臟中Th9、Th1細(xì)胞比率。探索腹腔注射抗IL-9抗體治療肝癌惡性腹腔積液的療效及作用機(jī)制。方法:取傳代第7天H22肝癌腹水小鼠1只,吸取小鼠腹腔乳白色瘤液后,用生理鹽水將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為1×10~7/mL。然后將0.2 ml(相當(dāng)于瘤細(xì)胞數(shù)2×10~6/只)腫瘤細(xì)胞懸液注射到每只小鼠腹腔內(nèi),制備H22肝癌腹水小鼠模型。造模2周后ELISA檢測(cè)模型小鼠腹水和外周血中IL-9、IFN-γ濃度,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其脾臟中Th9、Th1細(xì)胞比例。然后于造模24h后將60只小鼠隨機(jī)分成三組,即空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組�？瞻讓�(duì)照組給予腹腔注射生理鹽水,陰性對(duì)照組給予腹腔注射同型IgG抗體,實(shí)驗(yàn)組給予腹腔注射抗IL-9抗體,隔天一次,共注射5次。每次注射前均稱量各組小鼠體重,測(cè)小鼠腹圍,并觀察小鼠日�；顒�(dòng)狀態(tài)。末次用藥結(jié)束24h后每組處死5只小鼠,測(cè)量MA體積,收集MA上清采用ELISA法檢測(cè)MA中VEGF?IL-9、IFN-γ表達(dá)水平。留取小鼠脾臟,分離脾臟中淋巴細(xì)胞,采用刺激阻斷劑預(yù)處理4個(gè)小時(shí)后,進(jìn)行表面CD4抗原染色,然后破膜進(jìn)行胞內(nèi)IL-9,IFN-γ染色,染色后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟中Th9細(xì)胞、Th1細(xì)胞比例。末次用藥結(jié)束24h后每組取5只小鼠,每只小鼠予靜脈注射濃度為50 mg/ml的伊文藍(lán)各0.2 ml,注射2h后收集腹水,離心后留取上清,然后用酶標(biāo)儀檢測(cè)腹水上清的吸光度值。其余小鼠觀察其生存時(shí)間。結(jié)果:與正常對(duì)照組小鼠對(duì)比,H22肝癌腹水小鼠腹水中IL-9、IFN-γ濃度升高,脾臟中Th9細(xì)胞、Th1細(xì)胞比例升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);干預(yù)后實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組小鼠MA的體積分別為(8.44±1.13)mL、(10.88±1.35)mL、(10.56±2.10)mL,與照組相比實(shí)驗(yàn)組小鼠MA的體積顯著減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。實(shí)驗(yàn)組小鼠中位生存時(shí)間為18天(17-20天),顯著長(zhǎng)于陰性對(duì)照組14天(13-17天)和空白對(duì)照組14天(13-16天),Log-rank檢驗(yàn)顯示與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組小鼠生存時(shí)間顯著延長(zhǎng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組H22肝癌腹水小鼠腹水上清中VEGF、IL-9水平顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),但3組間IFN-γ水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。三組小鼠腹水上清的平均吸光度值為1.82±0.14,1.78±0.08和1.25±0.09,與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組小鼠腹水中伊文藍(lán)濃度顯著下降(p0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組小鼠給予抗IL-9抗體治療后脾臟中Th9細(xì)胞和Th1細(xì)胞比例下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論:H22肝癌腹水小鼠腹水中IL-9、IFN-γ濃度升高,脾臟中Th9細(xì)胞、Th1細(xì)胞比例升高;腹腔注射抗IL-9抗體治療可能通過(guò)降低體內(nèi)IL-9水平,減少Th9細(xì)胞形成,促使腫瘤細(xì)胞表達(dá)VEGF下降從而減輕H22肝癌腹水小鼠的腹膜血管滲透性,減少腹水的形成,延長(zhǎng)H22肝癌腹水小鼠的存活時(shí)間。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.7
【圖文】：

白介素 9 在肝癌及其所致惡性腹腔積液中的作用及機(jī)制研究 20二、結(jié)果1. IL-9 對(duì) SMMC-7721 細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響為探索 IL-9 是否對(duì)肝癌細(xì)胞存在直接毒性作用，本研究觀SMMC-7721 細(xì)胞后細(xì)胞形態(tài)的改變情況。將 SMMC-7721 細(xì)胞生長(zhǎng)期，分別在培養(yǎng)基內(nèi)加入終濃度為 12.5 ng/ mL, 25 ng/mL,重組人 IL-9 進(jìn)行干預(yù)，37℃培養(yǎng) 24 小時(shí)后，光鏡下觀察細(xì)胞形示與未進(jìn)行 IL-9 干預(yù)組相比，SMMC-7721 細(xì)胞形態(tài)并無(wú)顯著改積未見(jiàn)明顯的縮小，與周圍的細(xì)胞無(wú)脫離。見(jiàn)圖 1。

2. IL-9 對(duì) SMMC-7721 細(xì)胞凋亡的影響腫瘤是一種細(xì)胞凋亡過(guò)少而增殖過(guò)多的疾病,目前臨床上的多種抗腫瘤藥物的抗腫瘤作用是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡起作用的。為探索 IL-9 對(duì)肝癌細(xì)胞是否存在直接抗腫瘤作用，本研究在形態(tài)學(xué)觀察的基礎(chǔ)上，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) IL-9 干預(yù)后 SMMC-7721 細(xì)胞的凋亡情況。將培養(yǎng) SMMC-7721細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，分別在培養(yǎng)基內(nèi)加入終濃度為 12.5 ng/ mL, 25 ng/mL,50 ng/mL 的重組人 IL-9 進(jìn)行干預(yù)，37℃培養(yǎng) 24 小時(shí)后，收集細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)，結(jié)果顯示與未進(jìn)行 IL-9 干預(yù)組相比，SMMC-7721 細(xì)胞的凋亡率未見(jiàn)明顯改變。見(jiàn)圖 2。

圖 3. IL-9 干預(yù)后 SMMC-7721 細(xì)胞增殖情況。SMMC-7721 細(xì)胞增殖率隨 IL-9 的濃度<0.05）。Figure 3 Proliferation of SMMC-7721 cells after IL-9 intervention. Proliferation of SMMCwith elevated of IL-9 concentration.4. IL-9 促進(jìn) SMMC-7721 細(xì)胞的遷移和侵襲能力遷移和侵襲能力是惡性腫瘤的特性，惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移是腫瘤的主要原因。在本研究中，為探討 IL-9 對(duì)肝癌細(xì)胞遷移、侵襲能我們用 12.5 ng/ mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL 濃度的重組人 IL-9 干預(yù)SMMC-7721 細(xì)胞，采用 Transwell 法觀察腫瘤細(xì)胞遷移能力的變結(jié)果表明，與未予 IL-9 干預(yù)的對(duì)照組相比，外源性 IL-9 干預(yù)可癌細(xì)胞系 SMMC-7721 的遷移和侵襲能力（p<0.05），且這種促

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2784943