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白介素9在肝癌及其所致惡性腹腔積液中的作用及機制研究

發(fā)布時間:2020-08-08 03:01
【摘要】:全國腫瘤登記中心通過分析全國腫瘤發(fā)病與死亡資料,估計2015年全國肝癌相關死亡率在惡性腫瘤相關的死亡率中排名第3位,發(fā)病率在惡性腫瘤中位于第4位。盡管近年來醫(yī)學研究、醫(yī)療設備和醫(yī)療技術取得了很大的進步,但目前臨床上缺乏治療肝癌的有效方法。多數肝癌患者晚期會出現大量惡性腹腔積液(malignant ascites,MA),大量腹腔積液嚴重影響患者的生存質量?目前沒有治療惡性腹腔積液十分有效的方案。目前的研究認為血管滲透性增加和新生血管的形成是MA形成的主要機制。研究者認為拮抗血管內皮生長因子、基質金屬蛋白酶的作用可以減少MA的形成?但這些藥物的臨床療效有限,仍需尋找其他有效的治療手段。肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中多條信號通路起著重要的作用。目前的研究認為在肝癌、肺癌、乳腺癌等腫瘤組織和細胞中信號轉導與轉錄激活因子家族(signal transduction and activators of transcription,STATs)的重要成員STAT3異常表達和激活,STAT3參與了腫瘤細胞的增殖、分化和凋亡過程。免疫細胞及免疫因子參與了肝癌發(fā)生、發(fā)展的各個環(huán)節(jié)。白介素(IL)-9是Th9、Th17等多種免疫細胞分泌的免疫效應因子。IL-9通過與IL-9受體結合發(fā)揮生物學作用。目前的研究發(fā)現IL-9具有多種免疫效用,它即存在促炎作用又存在抗炎作用。但目前IL-9在腫瘤中的研究較少,IL-9與腫瘤的關系尚未明確。研究發(fā)現使用IL-9干預黑色素瘤細胞,可抑制細胞的生長。相反的是,在肺癌的研究發(fā)現IL-9能促進肺癌細胞的增殖。我們在前期的研究中發(fā)肝癌并惡性腹腔積液患者MA中Th9細胞比例以及IL-9濃度高于對應外周血水平,也高于肝硬化患者腹水中的水平。且相關性分析發(fā)現MA中Th9細胞比例以及IL-9水平與患者的生存時間呈負相關關系。那么Th9/IL-9對肝癌細胞的生物學行為存在怎樣的影響呢?Th9/IL-9是通過何種機制對肝癌細胞產生影響的呢?Th9/IL-9是否可以作為肝癌惡性腹腔積液干預治療的靶點呢?為探索上述問題我們將從以下兩方面進行研究:第一部分白介素-9對肝癌細胞的生物學作用及其機制研究目的:研究白介素(IL)-9干預后肝癌細胞增殖、遷移、侵襲等生物學行為的改變情況,并探索IL-9對肝癌細胞生物學行為生產影響的可能機制。方法:體外培養(yǎng)SMMC-7721細胞至對數生長期,將SMMC-7721細胞分成實驗組和對照組,實驗組分別予12.5 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL的重組人IL-9處理,對照組不予任何干預。干預細胞24h后,CCK8法檢測腫瘤細胞增殖情況,流式細胞術檢測細胞凋亡率;Transwell遷移和侵襲實驗檢測細胞遷移和侵襲能力。留取培養(yǎng)基上清ELISA檢測上清中MMP-2,MMP-9和VEGF水平。提取細胞RNA后RT-PCR檢測MMP-2,MMP-9和VEGF mRNA水平。提取細胞蛋白后Western-blot法檢測細胞中JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3表達水平。在探索IL-9對SMMC-7721細胞產生影響的機制的研究中,實驗組分別予50ng/mL IL-9、50 ng/mL IL-9+40umol/L AG490處理,對照組不做任何處理。干預細胞24h后,CCK8法檢測腫瘤細胞增殖情況;Transwell遷移和侵襲實驗檢測細胞遷移和侵襲能力。Western-blot法檢測細胞中STAT3和p-STAT3表達水平,RT-PCR檢測MMP-2,MMP-9和VEGF mRNA水平。結果:以12.5 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL濃度的IL-9干預SMMC-7721細胞24 h后,SMMC-7721細胞增殖率明顯上升,與此同時SMMC-7721細胞的遷移和侵襲能力亦增加(p0.05),且IL-9對SMMC-7721細胞增殖和轉移能力的促進作用隨著IL-9濃度的增高而增強。但在凋亡實驗中并未發(fā)現IL-9干預SMMC-7721細胞后,細胞的凋亡率發(fā)生明顯改變(p0.05)。對培養(yǎng)基上清進行ELISA檢測后發(fā)現,與對照組相比,實驗組在IL-9干預后上清中MMP-2,MMP-9和VEGF水平顯著升高(p0.05)。RT-PCR檢測結果亦顯示,與對照組相比,實驗組細胞在IL-9干預后細胞中MMP-2,MMP-9和VEGF mRNA的表達水平升高(p0.05)。與對照組比較,IL-9干預后SMMC-7721細胞中的JAK2、STAT3蛋白水平無明顯改變(p0.05),但p-JAK2、p-STAT3表達水平顯著增高(p0.05)。使用AG490預處理后,IL-9對SMMC-7721的增殖和轉移的促進作用被削弱(p0.05),且p-STAT3、MMP-2,MMP-9和VEGF mRNA的表達水平亦顯著降低(p0.05)。結論:IL-9以濃度依賴性促進肝癌細胞增殖、遷移和侵襲,但對細胞凋亡無顯著影響。IL-9對肝癌細胞生物學行為的促進作用是通過激活STAT3磷酸化,促進MMP-2,MMP-9和VEGF表達實現的。第二部分抗IL-9抗體對肝癌惡性腹水抑制作用的實驗研究目的:檢測肝癌惡性腹腔積液小鼠模型外周血和惡性腹腔積液中IL-9、IFN-γ濃度,檢測肝癌惡性腹腔積液小鼠模型脾臟中Th9、Th1細胞比率。探索腹腔注射抗IL-9抗體治療肝癌惡性腹腔積液的療效及作用機制。方法:取傳代第7天H22肝癌腹水小鼠1只,吸取小鼠腹腔乳白色瘤液后,用生理鹽水將細胞懸液濃度調整為1×10~7/mL。然后將0.2 ml(相當于瘤細胞數2×10~6/只)腫瘤細胞懸液注射到每只小鼠腹腔內,制備H22肝癌腹水小鼠模型。造模2周后ELISA檢測模型小鼠腹水和外周血中IL-9、IFN-γ濃度,流式細胞術檢測其脾臟中Th9、Th1細胞比例。然后于造模24h后將60只小鼠隨機分成三組,即空白對照組、陰性對照組和實驗組。空白對照組給予腹腔注射生理鹽水,陰性對照組給予腹腔注射同型IgG抗體,實驗組給予腹腔注射抗IL-9抗體,隔天一次,共注射5次。每次注射前均稱量各組小鼠體重,測小鼠腹圍,并觀察小鼠日常活動狀態(tài)。末次用藥結束24h后每組處死5只小鼠,測量MA體積,收集MA上清采用ELISA法檢測MA中VEGF?IL-9、IFN-γ表達水平。留取小鼠脾臟,分離脾臟中淋巴細胞,采用刺激阻斷劑預處理4個小時后,進行表面CD4抗原染色,然后破膜進行胞內IL-9,IFN-γ染色,染色后流式細胞術檢測脾臟中Th9細胞、Th1細胞比例。末次用藥結束24h后每組取5只小鼠,每只小鼠予靜脈注射濃度為50 mg/ml的伊文藍各0.2 ml,注射2h后收集腹水,離心后留取上清,然后用酶標儀檢測腹水上清的吸光度值。其余小鼠觀察其生存時間。結果:與正常對照組小鼠對比,H22肝癌腹水小鼠腹水中IL-9、IFN-γ濃度升高,脾臟中Th9細胞、Th1細胞比例升高,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);干預后實驗組、陰性對照組和空白對照組小鼠MA的體積分別為(8.44±1.13)mL、(10.88±1.35)mL、(10.56±2.10)mL,與照組相比實驗組小鼠MA的體積顯著減少,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。實驗組小鼠中位生存時間為18天(17-20天),顯著長于陰性對照組14天(13-17天)和空白對照組14天(13-16天),Log-rank檢驗顯示與陰性對照組和空白對照組相比,實驗組小鼠生存時間顯著延長,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);與陰性對照組和空白對照組相比,實驗組H22肝癌腹水小鼠腹水上清中VEGF、IL-9水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05),但3組間IFN-γ水平比較差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)。三組小鼠腹水上清的平均吸光度值為1.82±0.14,1.78±0.08和1.25±0.09,與陰性對照組和空白對照組相比,實驗組小鼠腹水中伊文藍濃度顯著下降(p0.05)。流式細胞術檢測結果顯示,與陰性對照組和空白對照組相比,實驗組小鼠給予抗IL-9抗體治療后脾臟中Th9細胞和Th1細胞比例下降,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。結論:H22肝癌腹水小鼠腹水中IL-9、IFN-γ濃度升高,脾臟中Th9細胞、Th1細胞比例升高;腹腔注射抗IL-9抗體治療可能通過降低體內IL-9水平,減少Th9細胞形成,促使腫瘤細胞表達VEGF下降從而減輕H22肝癌腹水小鼠的腹膜血管滲透性,減少腹水的形成,延長H22肝癌腹水小鼠的存活時間。
【學位授予單位】:廣西醫(yī)科大學
【學位級別】:博士
【學位授予年份】:2018
【分類號】:R735.7
【圖文】:

形態(tài)圖,形態(tài),細胞形態(tài),細胞


白介素 9 在肝癌及其所致惡性腹腔積液中的作用及機制研究 20二、結果1. IL-9 對 SMMC-7721 細胞形態(tài)學影響為探索 IL-9 是否對肝癌細胞存在直接毒性作用,本研究觀SMMC-7721 細胞后細胞形態(tài)的改變情況。將 SMMC-7721 細胞生長期,分別在培養(yǎng)基內加入終濃度為 12.5 ng/ mL, 25 ng/mL,重組人 IL-9 進行干預,37℃培養(yǎng) 24 小時后,光鏡下觀察細胞形示與未進行 IL-9 干預組相比,SMMC-7721 細胞形態(tài)并無顯著改積未見明顯的縮小,與周圍的細胞無脫離。見圖 1。

流式細胞術,抗腫瘤作用,細胞凋亡,抗腫瘤藥物


2. IL-9 對 SMMC-7721 細胞凋亡的影響腫瘤是一種細胞凋亡過少而增殖過多的疾病,目前臨床上的多種抗腫瘤藥物的抗腫瘤作用是通過誘導腫瘤細胞凋亡起作用的。為探索 IL-9 對肝癌細胞是否存在直接抗腫瘤作用,本研究在形態(tài)學觀察的基礎上,采用流式細胞術檢測 IL-9 干預后 SMMC-7721 細胞的凋亡情況。將培養(yǎng) SMMC-7721細胞至對數生長期,分別在培養(yǎng)基內加入終濃度為 12.5 ng/ mL, 25 ng/mL,50 ng/mL 的重組人 IL-9 進行干預,37℃培養(yǎng) 24 小時后,收集細胞進行流式檢測,結果顯示與未進行 IL-9 干預組相比,SMMC-7721 細胞的凋亡率未見明顯改變。見圖 2。

情況,癌細胞系,遷移能力,肝癌細胞


圖 3. IL-9 干預后 SMMC-7721 細胞增殖情況。SMMC-7721 細胞增殖率隨 IL-9 的濃度<0.05)。Figure 3 Proliferation of SMMC-7721 cells after IL-9 intervention. Proliferation of SMMCwith elevated of IL-9 concentration.4. IL-9 促進 SMMC-7721 細胞的遷移和侵襲能力遷移和侵襲能力是惡性腫瘤的特性,惡性腫瘤的轉移是腫瘤的主要原因。在本研究中,為探討 IL-9 對肝癌細胞遷移、侵襲能我們用 12.5 ng/ mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL 濃度的重組人 IL-9 干預SMMC-7721 細胞,采用 Transwell 法觀察腫瘤細胞遷移能力的變結果表明,與未予 IL-9 干預的對照組相比,外源性 IL-9 干預可癌細胞系 SMMC-7721 的遷移和侵襲能力(p<0.05),且這種促

【參考文獻】

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本文編號:2784943

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