【摘要】：研究背景及目的結(jié)直腸癌是最常見的消化道腫瘤之一,是導(dǎo)致癌癥死亡的第三大原因。該病通常是以良性腺瘤性息肉起病,逐漸發(fā)展為腺瘤伴高度不典型增生,最終進(jìn)展為浸潤性癌。盡管早期通過手術(shù)及術(shù)后化療可以有效地治療結(jié)直腸癌,但患者的高復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率仍給結(jié)直腸癌的治療帶來了巨大的挑戰(zhàn)。結(jié)直腸癌有著復(fù)雜的分子病理學(xué)基礎(chǔ),多種基因、多類分子、多條通路相互作用,使得腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制更為復(fù)雜。如果能夠發(fā)現(xiàn)多條促腫瘤轉(zhuǎn)移通路中的共激活因子,將會為結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究及靶向治療帶來巨大的進(jìn)步。Hippo信號通路在調(diào)節(jié)組織穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡及干細(xì)胞功能中發(fā)揮著重要的作用。YAP是Hippo信號通路下游的重要效應(yīng)分子,是多種癌癥的轉(zhuǎn)錄共激活因子。因此,YAP的表達(dá)異常會導(dǎo)致Hippo信號通路的功能紊亂,有助于癌癥的發(fā)生和發(fā)展。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化使腫瘤細(xì)胞失去細(xì)胞極性,發(fā)生形態(tài)改變,并增加細(xì)胞及細(xì)胞基質(zhì)間的相互作用,從而更易于細(xì)胞脫離原發(fā)灶,具有更強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。有研究表明上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的作用,如果YAP參與調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程,成為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵“開關(guān)”,將會為防止腫瘤轉(zhuǎn)移帶來新的治療靶點(diǎn)。本實驗旨在研究YAP在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平,分析YAP的表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理因素的關(guān)系,探討其表達(dá)對患者預(yù)后的影響;同時我們還將研究結(jié)腸癌原發(fā)灶及其多器官轉(zhuǎn)移灶中YAP及EMT標(biāo)志物表達(dá)水平的差異及相關(guān)性;并進(jìn)一步探究YAP調(diào)控結(jié)腸癌遷移、侵襲及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用及機(jī)制,為防止腫瘤轉(zhuǎn)移提供新的思路。第一部分YAP在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及其與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的相關(guān)性研究目的:以體內(nèi)組織為研究對象,研究YAP在結(jié)腸癌組織及其配對癌旁組織、結(jié)腸癌原發(fā)灶及其配對轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)水平;探究結(jié)腸癌原發(fā)灶及其多器官轉(zhuǎn)移灶中YAP及EMT標(biāo)志物表達(dá)水平的差異及相關(guān)性;分析YAP的表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理因素的關(guān)系,探討其表達(dá)對患者預(yù)后的影響。研究方法:1、收集符合納入條件的80例結(jié)腸癌原發(fā)灶及24例多器官轉(zhuǎn)移灶的組織蠟塊,通過組織免疫熒光染色和免疫組織化學(xué)法定位及半定量YAP、磷酸化YAP和N-鈣粘蛋白在不同組織內(nèi)的表達(dá)情況;分析不同組織內(nèi)YAP的表達(dá)與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的相關(guān)性;探討YAP的表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征及患者預(yù)后的關(guān)系。2、應(yīng)用GEO數(shù)據(jù)庫信息,根據(jù)不同的組織配對要求(癌與癌旁、原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶)選擇合適的數(shù)據(jù)集,并下載其內(nèi)芯片寡核苷酸微陣列數(shù)據(jù),定量分析YAP在不同組織內(nèi)的mRNA表達(dá)情況;在GEO數(shù)據(jù)庫中篩選出具有大樣本量、包含完整預(yù)后信息的結(jié)腸癌數(shù)據(jù)集,下載高通量數(shù)據(jù)樣本中患者的預(yù)后資料,分析和驗證YAP高表達(dá)對患者預(yù)后的影響。結(jié)果:1、結(jié)腸癌組織中YAP的mRNA及蛋白表達(dá)量高于正常結(jié)腸組織。2、結(jié)腸癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶組織中YAP的陽性表達(dá)率分別為80.00%和87.50%,N-鈣粘蛋白陽性表達(dá)率分別為61.25%和37.50%。N-鈣粘蛋白在結(jié)腸癌原發(fā)灶組織中的陽性表達(dá)率高于結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移灶組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。而YAP在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移灶組織中的陽性表達(dá)率高于結(jié)腸癌原發(fā)灶組織,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3、在結(jié)腸癌原發(fā)灶組織中,有47個樣本出現(xiàn)YAP與N-鈣粘蛋白的共同表達(dá),占所有病例的58.75%;在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移灶組織中,僅8個樣本出現(xiàn)YAP與N-鈣粘蛋白的共同表達(dá),占所有病例的33.33%。YAP與N-鈣粘蛋白的表達(dá)僅在結(jié)腸癌原發(fā)灶中呈正相關(guān)(r=0.5003,p0.05),在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移灶中兩者的表達(dá)沒有相關(guān)性(r=0.0325,p0.05)。4、YAP及N-鈣粘蛋白的陽性表達(dá)與腫瘤的浸潤深度及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(p0.0.5),而與腫瘤發(fā)生部位、大體形態(tài)、組織學(xué)類型、分化程度、大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管內(nèi)癌栓無關(guān)(p0.05)。5、YAP高表達(dá)患者的總生存時間較YAP低表達(dá)或不表達(dá)的患者明顯縮短。結(jié)論:1、YAP在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)明顯高于正常組織,可作為鑒別手術(shù)切緣干凈與否的一種判斷標(biāo)準(zhǔn)。2、YAP的陽性表達(dá)與腫瘤浸潤深度及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān),YAP高表達(dá)的腫瘤局部侵襲性更強(qiáng),更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。這說明YAP與腫瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制,尤其是轉(zhuǎn)移早期階段有關(guān),可作為提示腫瘤診療觀察的方向。3、YAP高表達(dá)患者的總生存期較短,提示YAP可作為考量患者預(yù)后情況的因素之一。4、YAP在腫瘤原發(fā)灶中可以通過調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化,促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。第二部分YAP在結(jié)腸癌侵襲、遷移及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用研究目的:以體外培養(yǎng)的細(xì)胞系為研究對象,研究YAP在結(jié)腸癌侵襲、遷移及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用及機(jī)制。研究方法:1、選取6種常見的結(jié)腸癌細(xì)胞系(SW480、SW620、SW1116、DLD-1、HT29和HCT116),分別提取總RNA、細(xì)胞總蛋白、胞核蛋白及胞漿蛋白;使用qRT-PCR及Western Blotting檢測YAP、p-YAP(Ser127)、E-鈣粘蛋白及N-鈣粘蛋白的表達(dá)水平;觀察具有不同細(xì)胞形態(tài)(鵝卵石樣、紡錘體樣)及臨床Dukes分期的細(xì)胞中YAP及EMT相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)是否有差異;篩選YAP表達(dá)較高的細(xì)胞系用于后續(xù)實驗。2、結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480及SW620分別感染“干擾YAP表達(dá)”的SiYAP和“使YAP過表達(dá)”的LV-YAP慢病毒載體;篩選出穩(wěn)定感染的細(xì)胞;使用qRT-PCR及Western Blotting檢測慢病毒感染后YAP的表達(dá)情況;利用Transwell細(xì)胞遷移及腫瘤侵襲實驗檢測YAP表達(dá)升高或降低對腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的影響。3、Western Blotting檢測YAP表達(dá)升高或降低對EMT相關(guān)分子標(biāo)志物及MMP2的影響。結(jié)果:1、6種結(jié)腸癌細(xì)胞系均有YAP的表達(dá),其中HCT116的總YAP表達(dá)水平最低,其余細(xì)胞系的YAP表達(dá)量沒有顯著差異。鵝卵石樣細(xì)胞及紡錘體樣細(xì)胞的總YAP表達(dá)差異不明顯。不同臨床Dukes分期的細(xì)胞,其總YAP表達(dá)量沒有顯著差異。2、LV-YAP過表達(dá)慢病毒載體感染細(xì)胞后可以有效增加YAP的表達(dá)量,SiRNA干擾慢病毒載體感染細(xì)胞后則可以有效減少YAP的表達(dá)量;干擾YAP表達(dá)可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力,反之,增加YAP的表達(dá)可以促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移及侵襲。3、干擾YAP表達(dá)可以使N-鈣粘蛋白、波形蛋白、snai1及MMP2表達(dá)水平減低,E-鈣粘蛋白表達(dá)水平升高,反之,增加YAP的表達(dá)量可以降低E-鈣粘蛋白表達(dá)而升高N-鈣粘蛋白、波形蛋白、snai1及MMP2的表達(dá)。結(jié)論:1、YAP的高表達(dá)是腫瘤細(xì)胞易發(fā)生侵襲及轉(zhuǎn)移的基本表現(xiàn)之一。2、抑制YAP的表達(dá)可以妨礙腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,是控制腫瘤轉(zhuǎn)移的有效途徑。3、YAP可以通過調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化,促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力。4、深入研究YAP的作用機(jī)制,可以尋找到控制腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生的治療藥物。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.35
【圖文】：

ＹＡＰ蛋白主要表達(dá)于結(jié)腸腺上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，間質(zhì)未見明顯表達(dá)。使用逡逑Ａｌｅｘａ邋Ｆｌｕｏｒ邋４８８綠色熒光染料，可觀察到結(jié)腸癌組織中ＹＡＰ陽性染色呈弱至中逡逑等程度的綠色熒光，而在正常結(jié)腸組織中ＹＡＰ表達(dá)陰性，見圖３。逡逑ＹＡＰ邐Ｄ邋ＡＰＩ邐Ｍｅｒｇｅ逡逑■Ｈ逡逑圖３組織免疫熒光染色法檢測ＹＡＰ在正常結(jié)腸及結(jié)腸癌組織中的表達(dá)逡逑（ｘ２００）逡逑２１逡逑

（亞型１）。原發(fā)結(jié)腸癌組織ＹＡＰ的ＲＱ值為１０．８８±０．３８，配對結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移組逡逑織ＹＡＰ的ＲＱ值為１０．５５±０．９３，Ｐ＝０．３４。兩者ＹＡＰ相對表達(dá)量的差異無統(tǒng)計學(xué)逡逑意義，見圖２。逡逑２０逡逑

總ＹＡＰ的表達(dá)陽性但ｐ－ＹＡＰ表達(dá)呈陰性的情況。由于無法半定量胞核ＹＡＰ的表逡逑達(dá)水平，故文中仍將總ＹＡＰ的表達(dá)情況作為討論對象。Ｎ－鈣粘蛋白主要表達(dá)于逡逑細(xì)胞質(zhì)中，少部分表達(dá)于細(xì)胞膜上，見圖４。邐－逡逑結(jié)腸癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶組織中ＹＡＰ的陽性表達(dá)率分別為８０．００％和８７．５０％，逡逑Ｎ－鈣粘蛋白陽性表達(dá)率分別為６１．２５％和３７．５０％，見表１和２。ＹＡＰ在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)逡逑移灶中的陽性表達(dá)率比結(jié)腸癌原發(fā)灶高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＾＝０．砂５，逡逑０．仍），而Ｎ－鈣粘蛋白在結(jié)腸癌原發(fā)灶中的陽性表達(dá)率顯著高于結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移灶，逡逑差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＾＝４．２２２，邋Ｐ＜０．０Ｓ）。逡逑在結(jié)腸癌原發(fā)灶組織中，有４７個樣本出現(xiàn)ＹＡＰ與Ｎ－鈣粘蛋白的共同表達(dá)，逡逑占所有病例的５８．７５％；在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移灶組織中，僅８個樣本出現(xiàn)ＹＡＰ與Ｎ－鈣粘逡逑蛋白的共同表達(dá)

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

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本文編號：2785108