【摘要】：背景:化療在癌癥綜合治療中占有重要地位。然而,化療藥物的毒副反應(yīng)和耐藥問題嚴(yán)重影響治療效果。特別是多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)使得聯(lián)合化療療效逐漸降低,導(dǎo)致治療失敗。多柔比星(Doxorubicin,DOX)是目前臨床化療中最廣泛使用的蒽環(huán)類藥物(Anthracyclines,ANTs)之一。蒽環(huán)類藥物是周期非特異性抗生素,對(duì)處于各生長周期的癌癥細(xì)胞均有殺滅作用。作為臨床最有效的廣譜抗癌藥物,蒽環(huán)類藥物應(yīng)用中同樣存在毒副反應(yīng)和耐藥兩個(gè)問題。蒽環(huán)類藥物通過代謝產(chǎn)生活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS),提高癌細(xì)胞內(nèi)氧化水平,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;大量活性氧簇也可引起癌細(xì)胞壞死,產(chǎn)生抗癌作用。另一方面氧化水平提高也誘導(dǎo)癌細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激防御通路活化,藥物代謝酶表達(dá)增加,導(dǎo)致毒副反應(yīng)增加,誘導(dǎo)耐藥。氧化應(yīng)激機(jī)制在蒽環(huán)類藥物作用及誘導(dǎo)耐藥中研究日益受到重視。核因子E2相關(guān)因子2/Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1信號(hào)通路(nuclear factor E2-related factor 2/Kelch-like ECH-associated protein 1,Nrf2-Keap1)是細(xì)胞內(nèi)最重要的抗氧化應(yīng)激調(diào)控通路。氧化應(yīng)激可激活該通路,致使Nrf2與抑制蛋白Keapl解偶聯(lián)并在多種蛋白激酶的磷酸化作用下轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核,與抗氧化反應(yīng)元件(Antioxidant response element,ARE)相結(jié)合,啟動(dòng)下游一系列抗氧化基因和Ⅱ相解毒酶的轉(zhuǎn)錄,發(fā)揮強(qiáng)大的抗氧化作用,恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)氧化-抗氧化平衡。激活Nrf2-Keap1信號(hào)通路可激活下游抗氧化酶類的轉(zhuǎn)錄表達(dá),產(chǎn)生抗氧化應(yīng)激作用;上調(diào)藥物代謝酶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)促進(jìn)藥物代謝;還可調(diào)控其它信號(hào)通路(如細(xì)胞自噬、抗凋亡通路),產(chǎn)生副反應(yīng),并誘導(dǎo)耐藥的產(chǎn)生,從而降低化療藥物療效。抑制Nrf2-Keap1信號(hào)通路已成為逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞耐藥的重要靶點(diǎn)之一。采用Nrf2-Keap1信號(hào)通路抑制劑與抗癌藥聯(lián)用,增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)化療藥的敏感性,改善化療藥物的治療效果,為癌癥治療提供新途徑。第一部分Nrf2-Keap1信號(hào)通路與多柔比星對(duì)白血病細(xì)胞K562作用的相關(guān)性目的:通過檢測DOX作用下K562細(xì)胞中Nrf2-Keap1信號(hào)通路、自噬相關(guān)蛋白及基因信使RNA(Message RNA,m RNA)表達(dá)情況;檢測DOX聯(lián)合放線菌酮作用下K562細(xì)胞中Nrf2蛋白的表達(dá)情況,探討Nrf2-Keap1信號(hào)通路與DOX對(duì)K562細(xì)胞作用的相關(guān)性。方法:1、CCK-8比色法檢測不同濃度的DOX對(duì)K562細(xì)胞的增殖影響,計(jì)算50%抑制濃度(IC50),確定DOX的實(shí)驗(yàn)濃度。2、Western blot方法檢測不同濃度的DOX作用于K562細(xì)胞4h及16h后,Nrf2-Keap1信號(hào)通路蛋白表達(dá)(Nrf2、Keap1、GCS、AKR1C1、CBR1)及自噬相關(guān)蛋白(Beclin-1、LC3、P62)表達(dá)水平。3、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測不同濃度的DOX作用于K562細(xì)胞4h及16h后,Nrf2-Keap1信號(hào)通路基因(Nrf2、GCLM、AKR1C1、CBR1)及自噬相關(guān)基因(Beclin-1、LC3、P62)的m RNA水平相對(duì)表達(dá)量。4、Western blot方法檢測DOX聯(lián)合放線菌酮作用于K562細(xì)胞后,Nrf2蛋白的半壽期。結(jié)果:1、不同濃度的DOX作用于K562細(xì)胞48h時(shí),K562細(xì)胞活性呈現(xiàn)濃度依賴性。小劑量DOX對(duì)K562細(xì)胞生長有刺激作用,大劑量DOX對(duì)K562細(xì)胞有明顯抑制生長的作用。IC50:1.13μg/ml。2、不同濃度的DOX作用于K562細(xì)胞4h時(shí),Nrf2-Keap1信號(hào)通路蛋白Nrf2和AKR1C1表達(dá)上調(diào)。Keap1、GCS蛋白表達(dá)無明顯變化。自噬通路蛋白Beclin-1,LC3表達(dá)上調(diào),P62表達(dá)無明顯變化。3、不同濃度的DOX作用于K562細(xì)胞16h時(shí),Nrf2-Keap1信號(hào)通路蛋白Nrf2、GCS、CBR1表達(dá)上調(diào)。Keap1、AKR1C1表達(dá)無明顯變化。自噬通路蛋白Beclin-1,LC3表達(dá)上調(diào),P62表達(dá)降低。4、不同濃度的DOX作用于K562細(xì)胞4h時(shí),實(shí)驗(yàn)組Nrf2、GCLM、AKR1C1、CBR1基因m RNA表達(dá)量無明顯變化。Beclin-1基因m RNA表達(dá)量明顯上調(diào),而LC3、P62基因m RNA表達(dá)量無明顯變化。5、不同濃度的DOX作用于K562細(xì)胞16h時(shí),實(shí)驗(yàn)組Nrf2基因m RNA表達(dá)量與陰性對(duì)照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GCLM、AKR1C1、CBR1基因m RNA表達(dá)量上調(diào)。Beclin-1基因m RNA表達(dá)量輕度上調(diào),LC3、P62基因m RNA表達(dá)量有所下調(diào)。6、DOX作用時(shí),采用放線菌酮抑制蛋白合成條件下,Nrf2蛋白的半壽期輕度延長。結(jié)論:DOX可以提高Nrf2蛋白累積量,激活Nrf2-Keap1信號(hào)通路,促進(jìn)下游靶基因GCLM、AKR1C1、CBR1轉(zhuǎn)錄表達(dá),蛋白水平升高。DOX可以激活細(xì)胞自噬。DOX通過提高細(xì)胞自噬水平,也可以增加Nrf2蛋白累積量,進(jìn)而激活Nrf2-Keap1信號(hào)通路。第二部分鴉膽子苦醇抑制Nrf2-Keap1信號(hào)通路與多柔比星作用的研究目的:探討鴉膽子苦醇(Brusatol)抑制Nrf2-Keap1信號(hào)通路對(duì)DOX作用于K562細(xì)胞的影響;并初步探討鴉膽子苦醇提高DOX抑制K562細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。為鴉膽子苦醇的臨床應(yīng)用提供的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1、Western blot方法檢測不同濃度鴉膽子苦醇作用16h后,K562細(xì)胞中Nrf2-Keap1信號(hào)通路蛋白(Nrf2、Keap1、AKR1C1)表達(dá),選擇合適的實(shí)驗(yàn)濃度。2、Western blot方法檢測100n M鴉膽子苦醇聯(lián)合不同濃度的DOX處理K562細(xì)胞后,Nrf2-Keap1信號(hào)通路蛋白(Nrf2、CBR1)表達(dá)及凋亡相關(guān)因子蛋白(cleaved-caspase 3/caspase 3)表達(dá)。3、CCK-8比色法檢測100n M鴉膽子苦醇聯(lián)合不同濃度的DOX作用48h后,K562細(xì)胞活性。結(jié)果:1、鴉膽子苦醇可抑制Nrf2蛋白及其下游AKR1C1蛋白表達(dá);對(duì)Keap1蛋白表達(dá)無明顯影響;100n M是合適劑量。2、在DOX作用時(shí),聯(lián)合鴉膽子苦醇可降低Nrf2和CBR1蛋白表達(dá),提高cleaved-caspase 3/caspase 3蛋白表達(dá)。3、鴉膽子苦醇可增強(qiáng)DOX誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡作用。結(jié)論:鴉膽子苦醇可抑制DOX誘導(dǎo)的K562細(xì)胞中Nrf2蛋白累積,抑制Nrf2-Keap1信號(hào)通路及下游靶蛋白表達(dá),進(jìn)而降低K562細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力。聯(lián)合鴉膽子苦醇處理K562細(xì)胞,可增強(qiáng)DOX誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡作用。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R733.7
【圖文】：

分析法(ANOVA)，P 值小于 0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié) 果1、DOX 對(duì)白血病細(xì)胞 K562 生長的影響本實(shí)驗(yàn)以白血病細(xì)胞 K562 為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。參考我們前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以 2 置 DOX 濃度梯度。CCK-8 比色法驗(yàn)證了 48h 時(shí)間點(diǎn)，不同濃度 DOX 對(duì) K的細(xì)胞毒作用(見圖 1)。結(jié)果顯示不同濃度 DOX (濃度范圍：0、0.019、0.0390.156、0.312、0.625、1.25、2.5、5、10、20μg/ml)作用 48h 對(duì) K562 細(xì)胞作小劑量 DOX 對(duì) K562 細(xì)胞生長有刺激作用。大劑量 DOX 對(duì) K562 細(xì)胞有明長的作用，且藥物劑量越大抑制作用越強(qiáng)，在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴關(guān)系，1.13μg/ml。選擇 1μg/ml 為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度，此濃度既能導(dǎo)致氧化應(yīng)激效應(yīng)，又細(xì)胞不至于死亡過多。

圖 3（右） DOX（0，0.25, 0.5，1μg/ml）作用于 K562 細(xì)胞 163、Nrf2-Keap1 信號(hào)通路基因（Nrf2、GCLM、AKR1C1、相關(guān)基因(Beclin-1、LC3、P62）的 mRNA 水平相對(duì)表達(dá)量。Real-time quantitative PCR 技術(shù)檢測不同濃度的 DOX（0.5，細(xì)胞 4h 后，實(shí)驗(yàn)組 Nrf2、GCLM、AKR1C1、CBR1 基因 mRNA與陰性對(duì)照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Beclin-1 基因 m調(diào)，而 LC3，P62 基因 mRNA 表達(dá)量無明顯變化。（見圖 4-10）Real-time quantitative PCR 技術(shù)檢測不同濃度的 DOX（0.5, 1細(xì)胞 16h 后，實(shí)驗(yàn)組 Nrf2 基因 mRNA 表達(dá)量與陰性對(duì)照組的差＞0.05）。GCLM、AKR1C1、CBR1 基因 mRNA 表達(dá)量上調(diào)。表達(dá)量輕度上調(diào)，LC3、P62 基因 mRNA 表達(dá)量有所下調(diào)。（見結(jié)果顯示 DOX 作用后，Nrf2 基因 mRNA 表達(dá)量無明顯變

號(hào)通路與多柔比星對(duì)白血病細(xì)胞 K562 作用的相關(guān)性 因轉(zhuǎn)錄水平機(jī)制激活 Nrf2-Keap1 信號(hào)通路。DOX 作用后，因轉(zhuǎn)錄水平機(jī)制提高細(xì)胞自噬水平。

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 范久億;李軍;丁士剛;;Wnt信號(hào)通路在結(jié)直腸側(cè)向發(fā)育型腫瘤中的研究進(jìn)展[J];胃腸病學(xué);2018年11期

2 王雪;張?jiān)u滸;;Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路參與自噬調(diào)控作用的研究進(jìn)展[J];中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào);2017年01期

3 許瑩萍;王菲菲;李大金;王凌;;雌激素-雌激素受體信號(hào)通路對(duì)趨化因子的調(diào)控作用研究進(jìn)展[J];生殖醫(yī)學(xué)雜志;2017年09期

4 蘇依拉其木格;;Hedgehog信號(hào)通路在肺癌中的研究進(jìn)展[J];健康之路;2016年09期

5 滕振平;邢飛躍;;細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2信號(hào)通路對(duì)B淋巴細(xì)胞的影響[J];中國藥物與臨床;2007年01期

6 杜嬋;姜保國;;許旺細(xì)胞增殖和分化過程中的信號(hào)通路[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2007年03期

7 史琳琳;趙鋒;高學(xué)軍;李慶章;;乳蛋白合成信號(hào)通路的研究進(jìn)展[J];中國畜牧獸醫(yī);2013年01期

8 舒揚(yáng);向敏;;Wnt信號(hào)通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用及相關(guān)機(jī)制[J];江蘇醫(yī)藥;2018年08期

9 劉曉光;陳佩杰;肖衛(wèi)華;;Wnt信號(hào)通路在骨骼肌損傷修復(fù)過程中的作用及機(jī)制研究[J];生命的化學(xué);2018年05期

10 劉艷芳;吳志遠(yuǎn);;分子信號(hào)通路在瘢痕疙瘩中的研究進(jìn)展[J];海南醫(yī)學(xué);2017年07期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 彭麗;章杰;劉偉;;病理性瘢痕相關(guān)信號(hào)通路的研究進(jìn)展[A];2015江西省首屆醫(yī)學(xué)美容整形聯(lián)合學(xué)術(shù)會(huì)議、江西省醫(yī)學(xué)會(huì)第十一次醫(yī)學(xué)美學(xué)與美容學(xué)術(shù)研討會(huì)、江西省第四次中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)學(xué)美容學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2015年

2 曾令啟;葉章群;陳志強(qiáng);楊為民;高文喜;;草酸激活人腎小管上皮細(xì)胞p38 MAPK信號(hào)通路的研究[A];中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)泌尿外科專業(yè)委員會(huì)第十四次全國學(xué)術(shù)會(huì)議暨2016年廣東省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)泌尿外科專業(yè)委員會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2016年

3 王俊成;;炎癥因子對(duì)成骨細(xì)胞分化過程中BMP信號(hào)通路的的影響[A];中華口腔醫(yī)學(xué)會(huì)口腔修復(fù)學(xué)專業(yè)委員會(huì)第十次全國口腔修復(fù)學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2016年

4 茍黎明;李春潔;李龍江;;經(jīng)典Wnt信號(hào)通路在下頜下腺分支形態(tài)發(fā)生過程中的作用與機(jī)制的初步研究[A];2017全國口腔頜面——頭頸腫瘤外科學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2017年

5 謝玲;項(xiàng)曉瓊;胡迎春;范寶星;霍艷英;李邦印;段瑞峰;張開泰;吳德昌;;細(xì)胞定位與信號(hào)通路檢測技術(shù)在hrnt-1基因功能研究中的應(yīng)用[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)學(xué)分會(huì)第三次全國中青年學(xué)術(shù)交流會(huì)論文匯編[C];2001年

6 茍黎明;李春潔;李龍江;;經(jīng)典Wnt信號(hào)通路在下頜下腺分支形態(tài)發(fā)生過程中作用與機(jī)制的初步研究[A];第十四次中國口腔頜面外科學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2018年

7 林泓域;Yimon Aye;;Wnt信號(hào)通路與Nrf2信號(hào)通路之間的微妙關(guān)系——靶向化學(xué)平臺(tái)T-REX在氧化還原信號(hào)通路研究方面的應(yīng)用[A];第十屆全國化學(xué)生物學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集（墻報(bào)）[C];2017年

8 張麗琳;常娜;蔣伶活;;鎘脅迫下MAPKs信號(hào)通路的應(yīng)答機(jī)制初探[A];第九屆中國模式真菌研討會(huì)摘要集[C];2016年

9 孫宏亮;許美花;王瑤;魯文賡;;Wnt信號(hào)通路在牛胎盤發(fā)育過程中的功能[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)產(chǎn)科學(xué)分會(huì)第十三次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2016年

10 陳娉婷;周小青;劉旺華;曹澤標(biāo);陳昱文;;中藥對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化相關(guān)信號(hào)通路調(diào)控研究進(jìn)展[A];第九次全國中西醫(yī)結(jié)合診斷學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2015年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 本報(bào)記者 白毅;mTOR信號(hào)通路為腫瘤治療提供新靶點(diǎn)[N];中國醫(yī)藥報(bào);2010年

2 記者 王丹;最強(qiáng)激光“照亮”藥靶重要信號(hào)通路[N];健康報(bào);2015年

3 ;完美實(shí)現(xiàn)信號(hào)通路間的自由切換[N];通信產(chǎn)業(yè)報(bào);2008年

4 本報(bào)特約撰稿 樊平;腫瘤信號(hào)通路靶點(diǎn)研發(fā)線吸睛[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2018年

5 衣曉峰　陳英云 記者 李麗云;結(jié)腸癌發(fā)生中新的信號(hào)通路找到[N];科技日?qǐng)?bào);2009年

6 劉海英;美發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞信號(hào)通路互動(dòng)機(jī)制[N];科技日?qǐng)?bào);2009年

7 衣曉峰;哈醫(yī)大發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌發(fā)生中新的信號(hào)通路[N];中國醫(yī)藥報(bào);2009年

8 記者 劉海英;英發(fā)現(xiàn)細(xì)胞信號(hào)通路新“剎車”蛋白[N];科技日?qǐng)?bào);2012年

9 中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院血液腫瘤科 呂躍 王華;難治性HL研究砥礪前行[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2013年

10 劉禹 記者 王春;個(gè)體衰老速度差異謎團(tuán)揭開[N];科技日?qǐng)?bào);2017年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 石超文;Wnt信號(hào)通路參與肺間質(zhì)干細(xì)胞分化的分子機(jī)制探討及特發(fā)性肺纖維化干預(yù)的基礎(chǔ)研究[D];南京大學(xué);2016年

2 張輝;Erythropoietin信號(hào)通路對(duì)成體大鼠脊髓內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2018年

3 吳慧;活性多肽的表達(dá)及功能研究[D];國防科學(xué)技術(shù)大學(xué);2017年

4 韓晶晶;Nrf2信號(hào)通路在急性移植物抗宿主病中的作用及機(jī)制研究[D];蘇州大學(xué);2018年

5 朱建偉;MAPK/纖調(diào)蛋白信號(hào)通路在氧化應(yīng)激介導(dǎo)慢性胰腺炎纖維化中的機(jī)制研究[D];中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué);2018年

6 孫海濤;NF-κB P65通過Wnt信號(hào)通路調(diào)控HSCs活化的分子機(jī)制及鱉甲寡肽I-C-F-6的干預(yù)作用[D];南方醫(yī)科大學(xué);2018年

7 魯茜;TGF-β1/PI3K/Akt信號(hào)通路在糖尿病腎病中的作用[D];南京醫(yī)科大學(xué);2013年

8 王凡;HIF-1信號(hào)通路在多囊卵巢綜合征中的作用及其調(diào)控機(jī)制[D];福建師范大學(xué);2017年

9 肖華;吡非尼酮抑制Hedgehog信號(hào)通路延緩肺纖維化[D];南方醫(yī)科大學(xué);2018年

10 鄭新春;IL-21R信號(hào)通路在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2018年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 張家宇;Nrf2信號(hào)通路對(duì)α-硫辛酸再生谷胱甘肽的作用機(jī)制研究[D];華中科技大學(xué);2017年

2 陶蓓;白芍總苷對(duì)人骨關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖的影響及對(duì)Wnt信號(hào)通路調(diào)控的研究[D];西南醫(yī)科大學(xué);2016年

3 鄭晴晴;構(gòu)巢曲霉中與鈣調(diào)磷酸酶Calcineurin相關(guān)的salA、vnxA、akrA的基因敲除以及功能研究[D];南京師范大學(xué);2015年

4 沈龍艷;Hedgehog信號(hào)調(diào)節(jié)Sufu蛋白細(xì)胞定位的機(jī)制研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2016年

5 劉懷澤;SENP1通過調(diào)控Glil的去SUMO化過程抑制Hedgehog信號(hào)通路[D];南京醫(yī)科大學(xué);2016年

6 張潔;冬眠不同時(shí)期達(dá)烏爾黃鼠骨路肌中內(nèi)盾網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的PERK信號(hào)通路的作用研究[D];西北大學(xué);2018年

7 王媛;p53和NF-κB信號(hào)通路在MTB感染AECⅡ細(xì)胞中的免疫調(diào)控作用[D];寧夏大學(xué);2018年

8 王光熙;白藜蘆醇的抗炎活性及其介TLR4/NF-κBp65/MAPKs信號(hào)通路發(fā)揮抗炎效應(yīng)的機(jī)制研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

9 周明星;基于Nrf2信號(hào)通路的天然抗氧化劑研究[D];山東大學(xué);2018年

10 楊靖;Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控HepG2細(xì)胞代謝的機(jī)制研究[D];廣東藥科大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2784467