【摘要】：背景:化療在癌癥綜合治療中占有重要地位。然而,化療藥物的毒副反應和耐藥問題嚴重影響治療效果。特別是多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)使得聯合化療療效逐漸降低,導致治療失敗。多柔比星(Doxorubicin,DOX)是目前臨床化療中最廣泛使用的蒽環(huán)類藥物(Anthracyclines,ANTs)之一。蒽環(huán)類藥物是周期非特異性抗生素,對處于各生長周期的癌癥細胞均有殺滅作用。作為臨床最有效的廣譜抗癌藥物,蒽環(huán)類藥物應用中同樣存在毒副反應和耐藥兩個問題。蒽環(huán)類藥物通過代謝產生活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS),提高癌細胞內氧化水平,誘導細胞凋亡;大量活性氧簇也可引起癌細胞壞死,產生抗癌作用。另一方面氧化水平提高也誘導癌細胞內氧化應激防御通路活化,藥物代謝酶表達增加,導致毒副反應增加,誘導耐藥。氧化應激機制在蒽環(huán)類藥物作用及誘導耐藥中研究日益受到重視。核因子E2相關因子2/Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1信號通路(nuclear factor E2-related factor 2/Kelch-like ECH-associated protein 1,Nrf2-Keap1)是細胞內最重要的抗氧化應激調控通路。氧化應激可激活該通路,致使Nrf2與抑制蛋白Keapl解偶聯并在多種蛋白激酶的磷酸化作用下轉移入細胞核,與抗氧化反應元件(Antioxidant response element,ARE)相結合,啟動下游一系列抗氧化基因和Ⅱ相解毒酶的轉錄,發(fā)揮強大的抗氧化作用,恢復細胞內氧化-抗氧化平衡。激活Nrf2-Keap1信號通路可激活下游抗氧化酶類的轉錄表達,產生抗氧化應激作用;上調藥物代謝酶基因轉錄表達促進藥物代謝;還可調控其它信號通路(如細胞自噬、抗凋亡通路),產生副反應,并誘導耐藥的產生,從而降低化療藥物療效。抑制Nrf2-Keap1信號通路已成為逆轉癌細胞耐藥的重要靶點之一。采用Nrf2-Keap1信號通路抑制劑與抗癌藥聯用,增強癌細胞對化療藥的敏感性,改善化療藥物的治療效果,為癌癥治療提供新途徑。第一部分Nrf2-Keap1信號通路與多柔比星對白血病細胞K562作用的相關性目的:通過檢測DOX作用下K562細胞中Nrf2-Keap1信號通路、自噬相關蛋白及基因信使RNA(Message RNA,m RNA)表達情況;檢測DOX聯合放線菌酮作用下K562細胞中Nrf2蛋白的表達情況,探討Nrf2-Keap1信號通路與DOX對K562細胞作用的相關性。方法:1、CCK-8比色法檢測不同濃度的DOX對K562細胞的增殖影響,計算50%抑制濃度(IC50),確定DOX的實驗濃度。2、Western blot方法檢測不同濃度的DOX作用于K562細胞4h及16h后,Nrf2-Keap1信號通路蛋白表達(Nrf2、Keap1、GCS、AKR1C1、CBR1)及自噬相關蛋白(Beclin-1、LC3、P62)表達水平。3、實時熒光定量PCR技術檢測不同濃度的DOX作用于K562細胞4h及16h后,Nrf2-Keap1信號通路基因(Nrf2、GCLM、AKR1C1、CBR1)及自噬相關基因(Beclin-1、LC3、P62)的m RNA水平相對表達量。4、Western blot方法檢測DOX聯合放線菌酮作用于K562細胞后,Nrf2蛋白的半壽期。結果:1、不同濃度的DOX作用于K562細胞48h時,K562細胞活性呈現濃度依賴性。小劑量DOX對K562細胞生長有刺激作用,大劑量DOX對K562細胞有明顯抑制生長的作用。IC50:1.13μg/ml。2、不同濃度的DOX作用于K562細胞4h時,Nrf2-Keap1信號通路蛋白Nrf2和AKR1C1表達上調。Keap1、GCS蛋白表達無明顯變化。自噬通路蛋白Beclin-1,LC3表達上調,P62表達無明顯變化。3、不同濃度的DOX作用于K562細胞16h時,Nrf2-Keap1信號通路蛋白Nrf2、GCS、CBR1表達上調。Keap1、AKR1C1表達無明顯變化。自噬通路蛋白Beclin-1,LC3表達上調,P62表達降低。4、不同濃度的DOX作用于K562細胞4h時,實驗組Nrf2、GCLM、AKR1C1、CBR1基因m RNA表達量無明顯變化。Beclin-1基因m RNA表達量明顯上調,而LC3、P62基因m RNA表達量無明顯變化。5、不同濃度的DOX作用于K562細胞16h時,實驗組Nrf2基因m RNA表達量與陰性對照組的差異無統(tǒng)計學意義。GCLM、AKR1C1、CBR1基因m RNA表達量上調。Beclin-1基因m RNA表達量輕度上調,LC3、P62基因m RNA表達量有所下調。6、DOX作用時,采用放線菌酮抑制蛋白合成條件下,Nrf2蛋白的半壽期輕度延長。結論:DOX可以提高Nrf2蛋白累積量,激活Nrf2-Keap1信號通路,促進下游靶基因GCLM、AKR1C1、CBR1轉錄表達,蛋白水平升高。DOX可以激活細胞自噬。DOX通過提高細胞自噬水平,也可以增加Nrf2蛋白累積量,進而激活Nrf2-Keap1信號通路。第二部分鴉膽子苦醇抑制Nrf2-Keap1信號通路與多柔比星作用的研究目的:探討鴉膽子苦醇(Brusatol)抑制Nrf2-Keap1信號通路對DOX作用于K562細胞的影響;并初步探討鴉膽子苦醇提高DOX抑制K562細胞增殖的作用機制。為鴉膽子苦醇的臨床應用提供的實驗依據。方法:1、Western blot方法檢測不同濃度鴉膽子苦醇作用16h后,K562細胞中Nrf2-Keap1信號通路蛋白(Nrf2、Keap1、AKR1C1)表達,選擇合適的實驗濃度。2、Western blot方法檢測100n M鴉膽子苦醇聯合不同濃度的DOX處理K562細胞后,Nrf2-Keap1信號通路蛋白(Nrf2、CBR1)表達及凋亡相關因子蛋白(cleaved-caspase 3/caspase 3)表達。3、CCK-8比色法檢測100n M鴉膽子苦醇聯合不同濃度的DOX作用48h后,K562細胞活性。結果:1、鴉膽子苦醇可抑制Nrf2蛋白及其下游AKR1C1蛋白表達;對Keap1蛋白表達無明顯影響;100n M是合適劑量。2、在DOX作用時,聯合鴉膽子苦醇可降低Nrf2和CBR1蛋白表達,提高cleaved-caspase 3/caspase 3蛋白表達。3、鴉膽子苦醇可增強DOX誘導K562細胞凋亡作用。結論:鴉膽子苦醇可抑制DOX誘導的K562細胞中Nrf2蛋白累積,抑制Nrf2-Keap1信號通路及下游靶蛋白表達,進而降低K562細胞抗氧化應激能力。聯合鴉膽子苦醇處理K562細胞,可增強DOX誘導K562細胞凋亡作用。
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R733.7
【圖文】：

分析法(ANOVA)，P 值小于 0.05 有統(tǒng)計學意義。結 果1、DOX 對白血病細胞 K562 生長的影響本實驗以白血病細胞 K562 為實驗對象。參考我們前期實驗結果，以 2 置 DOX 濃度梯度。CCK-8 比色法驗證了 48h 時間點，不同濃度 DOX 對 K的細胞毒作用(見圖 1)。結果顯示不同濃度 DOX (濃度范圍：0、0.019、0.0390.156、0.312、0.625、1.25、2.5、5、10、20μg/ml)作用 48h 對 K562 細胞作小劑量 DOX 對 K562 細胞生長有刺激作用。大劑量 DOX 對 K562 細胞有明長的作用，且藥物劑量越大抑制作用越強，在一定范圍內呈劑量依賴關系，1.13μg/ml。選擇 1μg/ml 為后續(xù)實驗濃度，此濃度既能導致氧化應激效應，又細胞不至于死亡過多。

圖 3（右） DOX（0，0.25, 0.5，1μg/ml）作用于 K562 細胞 163、Nrf2-Keap1 信號通路基因（Nrf2、GCLM、AKR1C1、相關基因(Beclin-1、LC3、P62）的 mRNA 水平相對表達量。Real-time quantitative PCR 技術檢測不同濃度的 DOX（0.5，細胞 4h 后，實驗組 Nrf2、GCLM、AKR1C1、CBR1 基因 mRNA與陰性對照組的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。Beclin-1 基因 m調，而 LC3，P62 基因 mRNA 表達量無明顯變化。（見圖 4-10）Real-time quantitative PCR 技術檢測不同濃度的 DOX（0.5, 1細胞 16h 后，實驗組 Nrf2 基因 mRNA 表達量與陰性對照組的差＞0.05）。GCLM、AKR1C1、CBR1 基因 mRNA 表達量上調。表達量輕度上調，LC3、P62 基因 mRNA 表達量有所下調。（見結果顯示 DOX 作用后，Nrf2 基因 mRNA 表達量無明顯變

號通路與多柔比星對白血病細胞 K562 作用的相關性 因轉錄水平機制激活 Nrf2-Keap1 信號通路。DOX 作用后，因轉錄水平機制提高細胞自噬水平。

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本文編號：2784467