【摘要】：肺癌是全球發(fā)病率最高的腫瘤,死亡率居男性腫瘤的首位,在我國的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢。其中非小細胞肺癌(NSCLC)約占85%,臨床癥狀出現(xiàn)時,多已發(fā)展到中晚期,傳統(tǒng)的治療方法效果并不理想,延長生存期有限,且治療費用很高。肺癌早發(fā)現(xiàn)早治療能明顯提高患者的生存率和生活質(zhì)量,資料顯示,I期肺癌患者10年存活率達88%,III/IV期肺癌患者5年存活率僅為15%左右。然而,早期肺癌常表現(xiàn)為無癥狀的肺微小結(jié)節(jié),即使X光胸片體檢也很難準確診斷,只有病灶大時胸片才能發(fā)現(xiàn)。低劑量CT能使早期肺癌檢出率明顯提高,但不適合常規(guī)體檢,并且目前還沒有診斷特異的肺癌分子生物標志物,因此大部分的肺癌患者在就診時已到晚期�？梢�,對NSCLC人群的早期篩查顯得非常必要。通過對肺癌基因及其作用機制的研究,實施精準分子靶向治療成為當前的重要研究方向。因此,通過在分子水平上探索NSCLC的發(fā)生發(fā)展機制,尋找特異性強、敏感性更高的分子作為診斷標志物或潛在的治療靶點,將為NSCLC的早期診斷和治療提供新策略,具有一定的公共衛(wèi)生意義。miRNA是一類進化保守的短鏈RNA分子,長約22 nt,它們的主要作用方式是通過與靶位點mRNA的3'非編碼區(qū)(3'-UTR)結(jié)合,誘導mRNA降解或抑制mRNA的翻譯過程,從而造成靶基因的蛋白質(zhì)水平下降。miRNA參與了癌癥患者體內(nèi)的多種生物學行為,包括細胞增殖、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移和疾病預后等,在不同類型的惡性腫瘤演變中miRNA均扮演了重要角色。單個miRNA可以同時靶向多個基因的mRNA,同時單個mRNA也可以同時被多種miRNA調(diào)節(jié)。由于細胞內(nèi)大量的miRNA的存在,這種雙向的調(diào)節(jié)方式構(gòu)成了細胞內(nèi)復雜的作用網(wǎng)絡,參與了生物體內(nèi)許多生理過程和疾病的發(fā)生。miRNA表達存在細胞或組織特異性,而疾病(包括腫瘤)的發(fā)生發(fā)展也表現(xiàn)為某些miRNA表達失調(diào)。近些年來,通過研究NSCLC組織中miRNA表達譜的分布,發(fā)現(xiàn)NSCLC中存在眾多表達失調(diào)的miRNA。研究證明這些特異性的miRNA與NSCLC的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、侵襲、增殖和預后密切相關(guān),可能成為惡性腫瘤診斷與治療的潛在生物標志物。miRNA在NSCLC中作用機制的研究已經(jīng)取得了較大進展,研究表明,眾多miRNA對NSCLC的發(fā)生發(fā)展具有重要的促進或抑制作用。我們的研究以NSCLC組織中特異性表達降低的miR-326為出發(fā)點,對其在NSCLC細胞中的生物學功能進行研究,從體內(nèi)外到體內(nèi)探討其對NSCLC的發(fā)生發(fā)展的影響,以期為NSCLC的早期診斷和治療提供新的研究依據(jù)。第一章肺癌組織以及NSCLC細胞系中miR-326表達水平的變化目的:為了驗證肺癌組織miRNA高通量測序數(shù)據(jù)中miR-326的表達差異,利用RT-PCR檢測miR-326在人類非小細胞肺癌(Non-small Cell Lung Cancer,NSCLC)患者癌組織以及癌旁組織中的表達差異情況,并在正常人胚肺成纖維細胞系 HELF 和人類 NSCLC 細胞系 A549、SPC-A-1、H1299、SK-MES-1 和 95-D 中驗證miR-326表達情況。方法:miR-326是從本課題組miRNA高通量測序數(shù)據(jù)中篩選出的具有顯著表達差異的miRNA,高通量測序顯示其在肺癌組織中低表達。利用qRT-PCR技術(shù),我們對來自武漢大學中南醫(yī)院腫瘤科39對肺癌和癌旁組織樣本中miR-326的表達進行測定。并且對人胚肺成纖維細胞系HELF和人類NSCLC細胞系A(chǔ)549、SPC-A-1、H1299、SK-MES-1 和 95-D 中 miR-326 表達進行了驗證。結(jié)果:通過對肺癌及癌旁組織中miR-326的表達進行比較分析,結(jié)果顯示,肺癌組織中miR-326的表達與癌旁組織存在明顯差異,且差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。肺癌中miR-326的表達明顯低于癌旁組織。同時,體外細胞實驗結(jié)果顯示,miR-326在正常肺細胞系中的表達明顯高于其在肺癌細胞中的表達,與組織中的表達趨勢一致,且與高通量測序結(jié)果一致。結(jié)論:miR-326在NSCLC組織中和肺癌細胞系中均呈現(xiàn)低表達。第二章miR-326對NSCLC細胞生物學行為及裸鼠體內(nèi)成瘤能力的影響目的:明確miR-326在人NSCLC細胞中的生物學功能及對裸鼠體內(nèi)NSCLC細胞成瘤的影響。方法:利用合成的miR-326模擬物和抑制劑及其陰性對照,瞬時轉(zhuǎn)染人NSCLC細胞株A549和SPC-A-1,探討miR-326在NSCLC細胞中的潛在生物學功能。采用CCK-8、BrdU和平板克隆三種方法,檢測miR-326對NSCLC細胞增殖能力的影響;利用流式細胞術(shù)檢測miR-326對NSCLC細胞凋亡的影響;利用劃痕和Transwell實驗觀察NSCLC細胞遷移和侵襲能力的變化。通過裸鼠成瘤實驗檢測miR-326在體內(nèi)環(huán)境下對NSCLC細胞成瘤能力的影響。結(jié)果:在細胞功能實驗中,CCK-8檢測表明在24、48、72和96 h時,miR-326 過表達組的 OD 值與對照組相比明顯降低,干擾 miR-326 組的 OD 值則明顯升高;BrdU結(jié)果顯示,miR-326過表達能顯著降低染紅細胞所占比例,減少NSCLC細胞的DNA合成,即抑制細胞的增殖。而miR-326抑制可提高染紅細胞所占比例,提示DNA的合成增多,細胞的增殖能力增強;流式細胞儀檢測的凋亡結(jié)果顯示,miR-326過表達可明顯增加肺癌細胞中處于早期凋亡的細胞比例,而干擾miR-326可明顯減少此比例;劃痕實驗結(jié)果顯示,miR-326過表達可顯著抑制NSCLC細胞A549和SPC-A-1的遷移能力,而抑制miR-326表達可顯著增強兩種NSCLC細胞的遷移能力;Transwell遷移和侵襲實驗結(jié)果顯示,抑制miR-326表達可顯著增強細胞的遷移和侵襲能力,而miR-326過表達可顯著降低NSCLC細胞的遷移和侵襲能力。裸鼠成瘤實驗顯示,miR-326過表達能明顯減少體內(nèi)腫瘤組織的體積,降低其重量,表明miR-326能抑制裸鼠皮下A549細胞的成瘤能力,因此,miR-326在體內(nèi)環(huán)境中也能顯著抑制肺癌細胞增殖。結(jié)論:miR-326能夠顯著抑制NSCLC細胞A549和SPC-A-1的增殖、侵襲和遷移能力并誘導細胞凋亡,并且其對體內(nèi)NSCLC增殖也具有顯著的抑制作用。因此miR-326是一種抑制癌癥發(fā)生和發(fā)展的miRNA。第三章miR-326通過靶向調(diào)控NSCLC中CCND1的表達發(fā)揮抑癌功能目的:探討miR-326在肺癌細胞中對CCND1的靶向調(diào)控作用機制及其對肺癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響。方法:利用生物信息學預測并驗證miR-326的靶標CCND1,通過熒光素酶報告基因驗證miR-326與CCND1結(jié)合的可能性。利用合成的miR-326模擬物和抑制劑改變肺癌細胞系中miR-326和CCND1的水平,運用qPCR和Western blot來驗證miR-326通過抑制CCND1表達來發(fā)揮抑癌作用。另外,我們運用侵襲實驗、遷移實驗、克隆形成實驗檢測了 CCND1對肺癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響。之后我們檢測了 miR-326對腫瘤生物學行為相關(guān)蛋白casepase-3、casepase-7、cyclin D2、p21、p57、MMP7、MMP9 以及 cleaved casepase-3 表達的影響。結(jié)果:miR-326能夠靶向結(jié)合CCND1的3'-UTR區(qū)域,miR-326過表達能夠顯著抑制細胞中CCND1表達,從而使CyclinDl蛋白表達水平降低。另外,miR-326 能夠影響肺癌細胞中 casepase-3、casepase-7、cyclinD2、p21、p57、MMP7、MMP9 以及 cleaved casepase-3 等的表達。結(jié)論:miR-326可通過調(diào)控CCND1信號通路來影響肺癌細胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移。
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R734.2
【圖文】：

圖２－１邋ＢｒｄＬＩ實驗檢測ｍｉＲ－３２６對Ａ５４９和ＳＰＯＡ－１細胞增殖的影響逡逑ＢｒｄＵ實驗結(jié)果與統(tǒng)計分析，與相應ＮＣ組比較，＊Ｐ＜０．０５ａ逡逑３１逡逑

的細胞劃痕寬度還較寬。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，ｍｉＲ－３２６過表達的細胞劃痕愈合率逡逑明顯低于對照組，抑制ｍｉＲ－３２６的細胞劃痕愈合率明顯高于對照組，具有統(tǒng)計學逡逑意義（圖２－４）。表明ｍｉＲ－３２６過表達明顯抑制Ａ５４９和ＳＰＣ－Ａ－１細胞的遷移能力，逡逑而抑制ｍｉＲ－３２６則使這兩種細胞的遷移能力顯著增強。逡逑另外，我們還采用Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室來檢測各組細胞的遷移和侵襲能力。與對逡逑照組相比，過表達ｍｉＲ－３２６組細胞的遷移和侵襲能力顯著下調(diào)，而抑制ｍｉＲ－３２６逡逑組細胞的遷移能力和侵襲能力則顯著上升，具有顯著的統(tǒng)計學差異（圖２－５）。逡逑３３逡逑

圖２－７Ａ－Ｂ）

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

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2 任永永;孔祥陽;伍超群;呂云輝;;宣威肺癌的致病環(huán)境因子研究和診治進展[J];腫瘤;2015年04期

3 劉志強;何斐;蔡琳;;吸煙、被動吸煙與肺癌發(fā)病風險的病例對照研究[J];中華疾病控制雜志;2015年02期

本文編號：2783382