【摘要】：研究背景:轉(zhuǎn)移是影響腫瘤預(yù)后的重要生物學(xué)行為,其過程由腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲等多個步驟組成。遷移主要是指腫瘤細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架變化引起的細(xì)胞變形以及腫瘤細(xì)胞所處位置的變化。RAC1是影響腫瘤細(xì)胞遷移的重要分子,它可通過影響細(xì)胞骨架重要組成成分β-acting進(jìn)而影響細(xì)胞的遷移能力。侵襲主要是指腫瘤細(xì)胞分泌相關(guān)成分,降解基底膜或細(xì)胞周圍結(jié)締組織成分,為腫瘤細(xì)胞的生長提供空間。MMP2可降解基底膜或細(xì)胞周圍成分,是決定腫瘤細(xì)胞侵襲能力的重要分子之一。腫瘤細(xì)胞通過遷移、侵襲等多個步驟完成轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn),WNK2對RAC1和MMP2均具有負(fù)相調(diào)節(jié)作用,進(jìn)而影響腫瘤的遷移和侵襲能力。CBX8隸屬于CBX蛋白家族,可與RING1a/b、BMI1等蛋白分子組成多梳蛋白抑制復(fù)合體1(polycomb repressive complex 1,PRC1),與PRC2共同誘導(dǎo)并維持基因的抑制狀態(tài)。CBX8在腦膠質(zhì)瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤組織中表達(dá)升高,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,如誘導(dǎo)白血病的發(fā)生、促使腫瘤細(xì)胞去分化、延緩腫瘤細(xì)胞衰老等。目前,多數(shù)研究認(rèn)為CBX8屬于癌基因,但結(jié)論并不確切。因此,通過研究不同腫瘤類型中CBX8的作用,可以更為確切的了解CBX8在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制。研究方法:1.CBX8在腫瘤組織中的表達(dá)情況:通過c Bio Portal for Cancer Genomics檢測CBX8在腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌和肺癌中的表達(dá)情況及對預(yù)后的影響。2.構(gòu)建CBX8過表達(dá)及低表達(dá)細(xì)胞系:選取腦膠質(zhì)瘤(U251MG,T98G)、乳腺癌(MCF7,MDA-MB-231)和肺癌(A549)為研究對象。構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄病毒載體的CBX8過表達(dá)及低表達(dá)質(zhì)粒,Lipofectamine 2000誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染上述細(xì)胞系,G418篩選CBX8過表達(dá)細(xì)胞系,Puromycin篩選CBX8低表達(dá)細(xì)胞系,建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。q RT-PCR及western blot驗(yàn)證CBX8表達(dá)情況。3.檢測不同CBX8表達(dá)情況下細(xì)胞遷移能力變化:以CBX8不同表達(dá)情況的U251MG、MCF7和A549為研究對象,進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn),通過比較無細(xì)胞覆蓋區(qū)域面積評估細(xì)胞遷移能力。以CBX8不同表達(dá)情況的U251MG、MDA-MB-231和A549為研究對象,進(jìn)行Transwell遷移能力檢測實(shí)驗(yàn),通過計(jì)數(shù)相同時間內(nèi)穿過小室的細(xì)胞數(shù)量評估細(xì)胞的遷移能力。以CBX8不同表達(dá)情況的U251MG、MDA-MB-231和A549為研究對象,培養(yǎng)相同時間后,經(jīng)三步染色法染色,觀察細(xì)胞形態(tài)變化,初步評估細(xì)胞骨架的變化情況。使用Alexa FluorTM 568 phalloidin對上述細(xì)胞的細(xì)胞骨架進(jìn)行染色,共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞β-acting含量及分布變化,以及細(xì)胞形態(tài)變化。4.檢測不同CBX8表達(dá)情況下細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力變化:以CBX8不同表達(dá)情況的U251MG、MDA-MB-231和A549為研究對象,進(jìn)行Transwell侵襲實(shí)驗(yàn),通過計(jì)數(shù)相同時間內(nèi)穿過小室的細(xì)胞數(shù)量評估細(xì)胞的侵襲能力。以CBX8不同表達(dá)情況的U251MG、MDA-MB-231和A549為研究對象,轉(zhuǎn)染Luciferase基因,構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。以免疫缺陷的NSG小鼠為研究對象,經(jīng)尾靜脈注射建立肺轉(zhuǎn)移動物模型。飼養(yǎng)4-6周后,通過小動物活體成像技術(shù)評估肺轉(zhuǎn)移情況。記錄小鼠體重及肺組織重量,間接評估肺轉(zhuǎn)移情況。通過HE染色觀察發(fā)生轉(zhuǎn)移的肺組織變化情況。5.CBX8不同表達(dá)情況對WNK2、RAC1和MMP2的影響:以CBX8不同表達(dá)情況的U251MG、T98G、MCF7、MDA-MB-231和A549為研究對象,q RT-PCR檢測WNK2、RAC1和MMP2含量變化。以CBX8不同表達(dá)情況的U251MG、MDA-MB-231和A549為研究對象,使用RAC1、MMP2活性檢測試劑盒檢測細(xì)胞系中RAC1和MMP2活性。NSG小鼠建立動物模型后4-6周,取外周血,使用MMP2活性檢測試劑盒檢測血清中RAC1和MMP2活性。以CBX8過表達(dá)的MDA-MB-231為研究對象,染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)驗(yàn)證CBX8是否與WNK2啟動子區(qū)域結(jié)合。6.WNK2對RAC1和MMP2調(diào)節(jié)作用的驗(yàn)證:以U251MG、MDA-MB-231和A549為研究對象,使用si RNA轉(zhuǎn)染上述細(xì)胞,q RT-PCR檢測WNK2表達(dá)情況后,選擇WNK2明顯降低細(xì)胞系為研究對象,q RT-PCR檢測RAC1和MMP2表達(dá)含量的變化,并與CBX8差異性表達(dá)細(xì)胞系中表達(dá)含量變化進(jìn)行比較。結(jié)果:1.通過c Bio Portal for Cancer Genomics檢索發(fā)現(xiàn),CBX8在不同腫瘤組織中均有不同程度的升高,特別是在腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌和肺癌中升高明顯。通過c Bio Portal for Cancer Genomics分析腦部腫瘤、乳腺癌和肺癌的總體生存率發(fā)現(xiàn),CBX8高表達(dá)可明顯降低腦膠質(zhì)瘤患者總體生存率(P=9.13e-05),而乳腺癌及肺癌中的結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2.成功建立U251MG、T98G、MCF7、MDA-MB-231和A549的CBX8過表達(dá)和低表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,并通過q RT-PCR和western blot進(jìn)行驗(yàn)證。3.以CBX8不同表達(dá)情況的U251MG、MCF7和A549為研究對象,進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn),比較72小時后空白區(qū)域面積發(fā)現(xiàn),隨著CBX8表達(dá)含量的升高,空白區(qū)域均有不同程度的縮小,提示CBX8表達(dá)含量的升高可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移能力的升高。其中U251MG和MCF7細(xì)胞系中,CBX8對照組和低表達(dá)組與CBX8過表達(dá)組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。A549細(xì)胞系中,僅CBX8過表達(dá)組與低表達(dá)組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,對照組與過表達(dá)組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以CBX8不同表達(dá)情況的U251MG、MDA-MB-231和A549為研究對象,進(jìn)行Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。處理8小時后,三步染色法染色細(xì)胞,比較穿過小室細(xì)胞數(shù)量的變化。結(jié)果提示,隨著CBX8表達(dá)含量的升高,穿過小室的數(shù)量逐漸增多,再次提示CBX8表達(dá)含量的升高可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移能力的升高。U251MG、MDA-MB-231和A549細(xì)胞系中,CBX8對照組和低表達(dá)組與CBX8過表達(dá)組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以CBX8不同表達(dá)情況的U251MG、MDA-MB-231和A549為研究對象,常規(guī)培養(yǎng)24小時后,經(jīng)三步染色法染色,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)存在差異。隨著CBX8含量的升高,細(xì)胞由圓形向梭形逐漸轉(zhuǎn)變。對上述細(xì)胞進(jìn)行Alexa FluorTM 568 phalloidin染色發(fā)現(xiàn),隨著CBX8含量的升高,各組細(xì)胞中β-acting表達(dá)含量明顯增多且向細(xì)胞膜方向分布,提示細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)活動增強(qiáng)。4.以CBX8不同表達(dá)情況的U251MG、MDA-MB-231和A549為研究對象,進(jìn)行Transwell侵襲能力檢測實(shí)驗(yàn),處理24小時后,三步染色法染色細(xì)胞,比較穿過小室細(xì)胞數(shù)量的變化。結(jié)果顯示,隨著CBX8表達(dá)含量的升高,穿過小室的細(xì)胞數(shù)量逐漸增多,提示CBX8表達(dá)含量的升高可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲能力的升高。U251MG和MDA-MB-231細(xì)胞系中,CBX8對照組和低表達(dá)組與CBX8過表達(dá)組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。A549各組之間差異僅有趨勢變化,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以CBX8不同表達(dá)情況的U251MG、MDA-MB-231和A549為研究對象,成功建立Luciferase基因穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。以NSG小鼠為研究對象,成功建立尾靜脈注射的肺轉(zhuǎn)移動物模型。飼養(yǎng)4-6周后行小動物活體成像發(fā)現(xiàn),隨著CBX8表達(dá)含量的升高,肺部轉(zhuǎn)移的發(fā)生率明顯升高,且肺部熒光明顯增強(qiáng),提示肺部轉(zhuǎn)移情況更為嚴(yán)重。比較CBX8對照組、低表達(dá)組和過表達(dá)組小鼠體重及肺組織重量發(fā)現(xiàn),隨著CBX8的升高,小鼠體重逐漸降低,肺組織重量逐漸升高,間接提示肺轉(zhuǎn)移情況逐漸加重。HE染色發(fā)現(xiàn),隨著CBX8表達(dá)含量的升高,小鼠肺組織中的轉(zhuǎn)移灶數(shù)量逐漸增多,且轉(zhuǎn)移灶面積逐漸增大,直接提示肺部轉(zhuǎn)移情況的加重。5.以CBX8不同表達(dá)情況的U251MG、T98G、MCF7、MDA-MB-231和A549為研究對象,q RT-PCR檢測WNK2、RAC1和MMP2含量變化。結(jié)果顯示:隨著CBX8表達(dá)含量的逐漸升高,WNK2表達(dá)含量逐漸降低,RAC1和MMP2表達(dá)含量逐漸升高,提示CBX8與WNK2之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系,與RAC1和MMP2之間存在正向相關(guān)關(guān)系。以CBX8不同表達(dá)情況的U251MG、MDA-MB-231和A549為研究對象,使用MMP2活性檢測試劑盒檢測細(xì)胞系中和動物血清中RAC1和MMP2活性。結(jié)果顯示:隨著CBX8的逐漸升高,細(xì)胞系及動物血清中RAC1和MMP2的活性均有不同程度的升高,再次提示CBX8與RAC1和MMP2之間存在正向相關(guān)關(guān)系。以CBX8過表達(dá)的MDA-MB-231為研究對象,通過免疫共沉淀技術(shù)檢測CBX8與WNK2之間的關(guān)系,結(jié)果顯示,CBX8可與WNK2啟動子區(qū)域結(jié)合,提示CBX8可以直接調(diào)控WNK2表達(dá)含量變化。6.以U251MG、MDA-MB-231和A549為研究對象,使用si RNA轉(zhuǎn)染上述細(xì)胞,q RT-PCR檢測WNK2表達(dá)情況,4組si RNA中選取WNK2降低最明顯的2組(分別降低32.1%和46.5%),q RT-PCR檢測RAC1和MMP2表達(dá)含量的變化。結(jié)果顯示,RAC1和MMP2均有不同程度的降低,與CBX8差異性表達(dá)細(xì)胞系中表達(dá)含量變化一致,提示CBX8可通過WNK2調(diào)節(jié)RAC1和MMP2。結(jié)論:以上結(jié)果提示,CBX8在腫瘤組織中過表達(dá)并在部分腫瘤類型中影響預(yù)后。過表達(dá)的CBX8可以增加腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力,進(jìn)而增加遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的可能。以上腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的變化主要是通過CBX8直接調(diào)控WNK2,進(jìn)而調(diào)節(jié)RAC1和MMP2完成的。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R730.2
【圖文】：

圖 1：CBX 蛋白結(jié)構(gòu)。% of identify：目的氨 酸在總氨 酸中的百分比； % of highconservation：高度保守氨 酸數(shù)目在總氨 酸數(shù)目中的比例（圖片引用于 Ma RG, Zhang Y,Sun TT, et al. Epigenetic regulation by polycomb group complexes: focus on roles of CBX proteins. JZhejiang Univ Sci B. 2014; 15(5):412-28.）[9]。一般而言，CBX 蛋白可通過蛋白質(zhì)結(jié)合域使組蛋白 H3 賴氨酸 27 三甲基化(H3K27me3)，進(jìn)而募集 PRC1 其他成員到特定的染色質(zhì)區(qū)域，抑制相關(guān)基因的表達(dá)。已有文獻(xiàn)提示，不同 CBX 蛋白對不同的甲基化位點(diǎn)具有不同的親和能力，如 CBX2、CBX7 均可誘導(dǎo) H3K9me3 和 H3K27me3，而 CBX4 誘導(dǎo) H3K9me3的能力較強(qiáng)。CBX 蛋白 C 端的多梳抑制框主要參與轉(zhuǎn)錄抑制或與其他 PRC1 組分進(jìn)行結(jié)合，如 RING1B 等[10-12]。在 CBX2 中，染色質(zhì)結(jié)合域附近存在 AT-hook區(qū)，而 CBX4，CBX6，CBX7，CBX8 中則存在 AT-hook 類似區(qū)。CBX 蛋白中間區(qū)域?yàn)榉潜Ｊ貐^(qū)域，可能與蛋白特異性結(jié)合靶基因有關(guān)[13,14]。目前發(fā)現(xiàn)，在不同物種間，同一物種不同細(xì)胞間，以及同一細(xì)胞的不同階段，CBX 蛋白表達(dá)的種類、數(shù)量均不同。其賴以發(fā)揮功能的 PcG 蛋白復(fù)合體的組成

天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文 一、CBX8 在不同腫瘤類型中的表達(dá)情況及臨床意義高，RPKM（Reads Per Kilobase per Million mapped reads）分別為 4.62，3.12 和2.04。其余組織中表達(dá)情況基本相同，均為低表達(dá)（如圖 1.1）。結(jié)合 TCGA 數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，腫瘤組織中 CBX8 均有不同程度的升高（如圖1.2）。

CBX8在瘤組和正常組中的表達(dá)情況：與正常組相比，瘤組中CBX8具有不同程度的升高

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本文編號：2783101