發(fā)布時(shí)間：2020-08-06 22:07

【摘要】：研究背景和目的非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占肺癌的85%以上,是導(dǎo)致癌癥死亡的常見(jiàn)原因。NSCLC的形成是一個(gè)復(fù)雜及多步驟的發(fā)展過(guò)程,它的異質(zhì)性高、生物學(xué)特性復(fù)雜,這就意味著發(fā)展適合于每種類型NSCLC特定治療方式的必然性。在NSCLC起始階段和腫瘤進(jìn)展中發(fā)現(xiàn)更多的發(fā)揮關(guān)鍵作用的腫瘤分子機(jī)制,以及尋找更多靈敏度高和特異性強(qiáng)的腫瘤標(biāo)志物,對(duì)于NSCLC的診療顯得尤為重要。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)不僅在抗氧化反應(yīng)中具有關(guān)鍵作用,而且在物質(zhì)代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)GPX基因家族在人類的多種腫瘤中異常表達(dá)。GPX8是家族中被最后確認(rèn)的成員,目前對(duì)于它的認(rèn)識(shí)還知之甚少,尤其在腫瘤中的研究更是鮮為人知�；贕PX家族在肺癌中的研究現(xiàn)狀,本課題擬從以下方面探索GPX8在NSCLC中發(fā)揮的主要作用。首先是應(yīng)用生物信息數(shù)據(jù)及收集的NSCLC患者的組織樣本和臨床資料分析GPX8在NSCLC中的表達(dá)情況以及與患者預(yù)后的相關(guān)性。其次在體外水平研究干擾GPX8表達(dá)后,對(duì)NSCLC生長(zhǎng)及遷移侵襲等生物學(xué)功能的影響。經(jīng)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)探索GPX8在NSCLC中發(fā)揮的可能作用機(jī)制及分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。研究方法1.收集具有完整臨床資料的NSCLC患者的新鮮組織,以及蠟塊組織并制作組織芯片。采用Westernblot、RT-qPCR、IHC技術(shù)檢測(cè)GPX8在NSCLC患者中表達(dá)情況及與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系。應(yīng)用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)及IHC染色結(jié)果分析GPX8在NSCLC中的表達(dá)情況與患者預(yù)后的相關(guān)性。2.以NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞和H520細(xì)胞為主要研究對(duì)象,進(jìn)一步探討GPX8對(duì)NSCLC細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。運(yùn)用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、CCK-8、細(xì)胞劃痕、等實(shí)驗(yàn),綜合分析GPX8在干擾前后對(duì)NSCLC細(xì)胞的細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、以及對(duì)其遷移與侵襲能力的影響。3.采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析GPX8干擾前后,差異表達(dá)基因的變化情況及其主要富集的信號(hào)通路。結(jié)果1.本課題組制作了六個(gè)包含282例NSCLC患者的的組織芯片。經(jīng)過(guò)IHC染色后,相應(yīng)的組織芯片有效利用率為88.3%。組織芯片制作結(jié)果較為理想。2.腫瘤組織中GPX8的陽(yáng)性率遠(yuǎn)高于正常肺組織,分別為66.7%及26.7%,具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(X2 = 9.643,P0.01)。GPX8的高度表達(dá)往往發(fā)生在腫瘤直徑較大、病理分化程度較低、TNM分期較晚及出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)的NSCLC患者中。并且GPX8在肺腺癌中的表達(dá)高于其他NSCLC的病理類型。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)GPX8陽(yáng)性者的五年生存率較陰性患者要低(P=0.001),與TCGA生物信息學(xué)分析的結(jié)果一致。3.應(yīng)用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和CCK-8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),GPX8降表達(dá)后,貼壁的A549細(xì)胞和H520細(xì)胞的增殖能力下降,形成的克隆數(shù)明顯減少(P0.001)。進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GPX8對(duì)它們細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響,發(fā)現(xiàn)干擾GPX8表達(dá)后,并未對(duì)A549和H520的細(xì)胞周期造成明顯的影響。但GPX8降表達(dá)后,A549和H520細(xì)胞的早期凋亡比例明顯升高,依次為:16.25±1.06,9.45±1.06;高于對(duì)照組 2.85±0.92,3.85±1.06。4.在細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)干擾GPX8表達(dá)后,A549細(xì)胞和H520細(xì)胞的定向遷移能力明顯減弱,A549-shGPX8和H520-shGPX8穿過(guò)Matrigel膠小室的細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組明顯減少,遷移侵襲能力隨之下降。5.在A549細(xì)胞內(nèi)干擾GPX8表達(dá)后,顯著性差異表達(dá)的基因共計(jì)413個(gè)。經(jīng)過(guò)KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)的基因主要富集在癌癥通路及PI3K-Akt信號(hào)通路中。結(jié)論1.在NSCLC中,GPX8的表達(dá)水平呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì),與多項(xiàng)不良的臨床病理參數(shù)成正相關(guān)。2.GPX8是造成NSCLC患者預(yù)后不良的因素之一,可作為評(píng)判NSCLC患者預(yù)后的腫瘤分子標(biāo)記物。3.在肺腺癌中,GPX8的表達(dá)遠(yuǎn)高于其他病理類型,可作為鑒別NSCLC病理分型的重要依據(jù)。4.在NSCLC中,GPX8促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲,并抑制其凋亡。5.干擾GPX8的表達(dá)后,利用高通量的測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了 A549細(xì)胞內(nèi)的顯著差異性表達(dá)基因及其所富集的主要信號(hào)通路。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R734.2
【圖文】：

圖１．１制作ＴＭＡ的簡(jiǎn)易操作流程示意圖逡逑１．１．３．２蘇木素－伊紅染色逡逑

我們制作了六個(gè)包含２８２例ＮＳＣＬＣ患者的ＴＭＡ蠟塊，其中包括３０例肺癌逡逑患者相對(duì)應(yīng)的正常肺組織；ＴＭＡ蠟塊依次編號(hào)為Ｌｕｎｇ①至Ｌｕｎｇ⑥，除Ｌｕｎｇ⑥逡逑ＴＭＡ蠟塊上為４２個(gè)芯片點(diǎn)外，其余皆為４８?jìng)�(gè)芯片點(diǎn)。如圖１．２所示，所有ＴＭＡ逡逑蠟塊及切片上的芯片點(diǎn)排列整齊，在每張ＴＭＡ切片上未出現(xiàn)皺褶現(xiàn)象，個(gè)別芯逡逑片點(diǎn)出現(xiàn)移位，多發(fā)生在起始端。ＴＭＡ切片上位于上端獨(dú)立成列的點(diǎn)為識(shí)別點(diǎn)。逡逑隨機(jī)選取每個(gè)編號(hào)的ＴＭＡ切片各十張，在這些ＴＭＡ切片上觀察到平均共有９逡逑個(gè)芯片點(diǎn)發(fā)生完全脫落，組織芯片利用率為９６．８％，ＴＭＡ切片制作效果優(yōu)良，逡逑可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。逡逑—邐邐１．邐邐Ｉ逡逑圖１．２非小細(xì)胞肺癌ＴＭＡ蠟塊及切片逡逑１．２．邋２非小細(xì)胞肺癌組織芯片的ＨＥ染色逡逑將六張ＴＭＡ切片全部進(jìn)行ＨＥ染色（圖１．３），發(fā)現(xiàn)有１５個(gè)芯片點(diǎn)發(fā)生脫逡逑落，ＴＭＡ的ＨＥ切片利用率為９４．６％。在顯微鏡下觀察每個(gè)芯片點(diǎn)的染色情況逡逑及形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，評(píng)判所有供體蠟塊組織芯植入ＴＭＡ蠟塊后是否存在富含腫瘤細(xì)逡逑胞目的靶點(diǎn)的偏移甚至發(fā)生脫靶現(xiàn)象（圖１．４）。每個(gè)芯片點(diǎn)的組織內(nèi)除了腫瘤逡逑成分

圖１．３非小細(xì)胞肺癌ＴＭＡ切片ＨＥ染色結(jié)果逡逑ｍｍ逡逑ＨＥ染色，５Ｘ逡逑圖１．４非小細(xì)胞肺癌ＴＭＡ切片ＨＥ染色，圖Ａ黑色箭頭指向的區(qū)域?yàn)槟[瘤細(xì)胞逡逑成分，可以看到腫瘤組織明顯出現(xiàn)偏移，并且腫瘤細(xì)胞含量不足２５％，造成此逡逑靶點(diǎn)偏移的主要原因就是供體蠟塊的定位出現(xiàn)問(wèn)題；圖Ｂ所有黑色箭頭指向的逡逑粉染區(qū)域皆是腫瘤壞死區(qū)，在肺的鱗狀細(xì)胞癌中常常伴有腫瘤細(xì)胞的壞死。逡逑１１逡逑

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本文編號(hào)：2783031