【摘要】：我國是胃癌高發(fā)國家,胃癌發(fā)病和死亡例數(shù)分別占全球胃癌發(fā)病和死亡的42.6%和45.0%。中國腫瘤登記年報顯示,2015年胃癌新發(fā)病例約為67.9萬例,胃癌死亡病例約為49.8萬例。而且,胃癌具有高度異質性,療效差,易復發(fā),預后差等特點,嚴重威脅人民健康。手術是根治早期胃癌的主要治療手段,而傳統(tǒng)化療和放療是進展期和復發(fā)轉移性胃癌重要治療手段。近年來,胃癌的精準治療方興未艾,以HER-2、VEGFR-2、PD-1/PD-L1為靶點的靶向治療和免疫治療實現(xiàn)了晚期胃癌治療的突破,但胃癌整體人群的預后仍亟待改善。因此,深入研究胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機制,探尋新的更為有效的治療靶點和方法已成為研究的熱點。miRNAs是一種長度約為21-25個核苷酸的單鏈非編碼RNA,與靶基因的3′非編碼區(qū)相互結合,可降解或抑制靶基因mRNA表達,發(fā)揮轉錄后調控作用。眾多研究證實,miRNAs可調控大約30%mRNAs,具有強大的生物學功能。miRNAs失調與多種腫瘤存在因果關系,可作為抑癌基因或癌基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。近年來,miRNA模擬物和抑制劑在臨床前研究中取得可喜的初步療效。多種針對miRNA的靶向治療已開展臨床研究,顯示出良好的發(fā)展前途。miRNA-33(miR-33)位于膽固醇調節(jié)元件結合蛋白(Sterol regulatory element-binding protein,SREBP)基因的內含子序列,包括a/b兩個成員。既往研究顯示,miR-33主要功能為協(xié)同其宿主基因調節(jié)膽固醇和脂肪酸的代謝。其功能相關靶基因主要包括ABCA1、ABCG1、NPC1、AMPK、Cpt1a、Crot和Sirt6等。最為經典的通路為miR-33靶向抑制ABCA1,從而導致膽固醇的輸出降低,HDL的合成減少。近年來,文獻報道m(xù)iR-33可能在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。多數(shù)研究認為,miR-33a的主要功能為抑癌基因,但也有報道認為miR-33a是一種癌基因。miR-33a在不同腫瘤中調控的信號通路不盡相同,而且在不同腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用各不相同。因此,miR-33a在惡性腫瘤中的作用和機制有待進一步深入研究。而且,對于miR-33在胃癌組織中的表達、功能和調控機制尚不清楚。本研究采用逆轉錄實時定量聚合酶鏈反應(Quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測了miR-33家族2個成員miR-33a/b在胃癌組織和配對癌旁非癌組織中的表達,并分析了miR-33a的表達水平與胃癌患者臨床病理特征、腫瘤標記物以及預后的關系。采用qRT-PCR技術檢測了1種正常胃粘膜上皮細胞株GES-1和SGC-7901、MKN-28、HGC-27、BGC-823胃癌細胞株中miR-33a的表達,并通過miRNA轉染技術進行miR-33a的過表達或沉默,采用流式細胞技術、CCK-8(Cell-Counting Kit-8 assay)實驗、劃痕實驗和Transwell實驗研究了miR-33a對胃癌細胞株SGC-7901增殖、細胞周期和侵襲遷移等生物學功能的影響。通過生物信息學軟件,預測miR-33a下游調控的靶序列;利用雙熒光素酶報告基因分析檢測miR-33a對其預測靶基因CDK-6、CCND-1、PIM1和P53的靶向作用;采用qRT-PCR和Western-blot檢測轉染miR-33a mimic和抑制劑后胃癌細胞株SGC-7901中預測靶基因CDK-6、CCND-1和PIM1表達變化,明確miR-33a對靶基因的調控作用;檢測胃癌組織和其配對癌旁組織中CDK-6、CCND-1和PIM1的表達,驗證miR-33a表達與預測靶基因之間的調控關系。主要研究內容和結果如下:第一部分miR-33a/b在胃癌組織中表達及其與臨床病理特征及預后關系目的:檢測miR-33家族在胃癌組織和配對癌旁組織中的表達情況,探討miR-33家族表達與胃癌患者臨床病理學特征及預后的關系。方法:采用qRT-PCR技術檢測miR-200家族在胃癌組織和配對癌旁非癌組織中的表達差異。分析miR-33a表達差異及其與胃癌患者臨床病理學特征、腫瘤標志物和胃癌患者術后無疾病生存期(DFS)的關系。結果:1.miRNA-33 a/b在胃癌組織和配對癌旁組織中的表達。57例胃癌患者術后組織標本和配對癌旁組織中,miR-33a和miR-33b表達的下調率分別是75.44%(43/57)和56.14%(32/57)。胃癌組織中miR-33a表達(Median:0.04516;Interquartile Range:0.74817)顯著低于配對癌旁組織中的miR-33a表達(Median:0.07197;Interquartile Range:1.39304,P0.001)。而胃癌組織中miR-33b的表達(Median:0.00372;Interquartile Range:0.00521)與癌旁組織表達(Median:0.00371;Interquartile Range:0.00681)無顯著差異(P=0.113)。2.胃癌組織miR-33a表達與胃癌患者臨床病理學特征的關系。在57例胃癌患者中,miR-33a表達與腫瘤分化程度、腫瘤TNM分期、T分期及M分期存在顯著相關性(P=0.000,P=0.002,P=0.005和P=0.000),與患者的性別、年齡、N分期和脈管瘤栓情況無顯著相關性(P=0.211,P=0.127,P=0.113,P=0.643)。采用多元線性回歸分析,發(fā)現(xiàn)腫瘤分化程度(Beta=-0.391;t=-3.164;P=0.003)、腫瘤M分期(Beta=-0.325;t=-2.016;P=0.049)與miR-33a的表達存在顯著負相關;而miR-33a表達與腫瘤T分期(Beta=-0.029;t=-0.169;P=0.867)、N分期(Beta=0.265;t=1.745;P=0.087)和脈管瘤栓(Beta=0.038;t=0.297;P=0.768)無顯著相關性。3.miR-33a表達與胃癌患者腫瘤標志物的關系。miR-33a表達與胃癌患者外周血中CA-199水平呈負相關(r=-0.407,P=0.002),但與胃癌患者外周血中CEA、CA-50、CA-724水平無顯著相關性(r=0.067,P=0.632;r=-0.214,P=0.132;r=-0.100,P=0.477)。4.miR-33a表達與胃癌術后患者DFS的關系。在57例胃癌患者有4例患者失訪,6例Ⅳ期患者,剔除以上10例患者后,共有47例患者進行術后DFS分析。所有患者的中位DFS為13.6月(6.0月-28.9月)。miR-33a高表達胃癌術后患者的DFS顯著高于miR-33a低表達患者[中位DFS(95%CI):16.6月(8.5月-24.7月)vs.9.8月(4.6月-15.0月),P=0.04]。小結:1.miR-33a表達在胃癌組織中顯著低于配對癌旁組織,而miR-33b表達在胃癌組織和癌旁組織之間無顯著差異,提示miR-33a可能在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。2.miR-33a表達與胃癌患者的腫瘤組織分化程度、遠處轉移及外周血中CA-199的水平顯著負相關,提示miR-33a可能參與胃癌細胞分化、增殖和轉移調控機制。3.胃癌組織miR-33a表達水平與胃癌術后患者的DFS顯著相關。與miR-33a低表達患者相比較,miR-33a高表達患者的DFS顯著延長。提示miR-33a可能成為胃癌患者潛在的預后影響因子。第二部分miR-33a對胃癌細胞生物學功能的影響及其調控機制目的:觀察胃癌細胞株與正常胃粘膜上皮細胞中miR-33a表達的差異;明確miR-33a在胃癌細胞株SGC-7901增殖、侵襲和遷移等生物學行為中的作用和機制。方法:采用qRT-PCR技術檢測了1種正常胃粘膜上皮細胞株GES-1和SGC-7901、MKN-28、HGC-27、BGC-823胃癌細胞株中miR-33a的表達差異;將miR-33a模擬物和抑制劑轉染入胃癌細胞株SGC-7901實現(xiàn)miR-33a沉默或過表達,應用流式細胞技術、CCK-8實驗、劃痕實驗和Transwell實驗研究觀察miR-33a表達變化對胃癌細胞株SGC-7901細胞周期、細胞增殖和侵襲遷移能力的影響。結果:1.miR-33a在4種胃癌細胞株及正常胃上皮細胞中的表達(Mean±SD)與正常胃粘膜上皮細胞株GES-1中的表達(1.00±0.112)相比較,miR-33a在胃癌細胞株MKN-28(0.341±0.031,P=0.000)、SGC-7901(0.581±0.042,P=0.000)、BGC-823(0.538±0.029,P=0.000)和HGC-27(0.701±0.049,P=0.002)中表達顯著降低。該結果與胃癌組織與癌旁組織之間的表達差異一致。2.人胃癌細胞株SGC-7901轉染miR-33a mimic和Inhibitor后miR-33a的表達變化本研究采用SGC-7901細胞設計體外細胞模型,利用qRT-PCR法檢測miR-33a mimic轉染組、mi R-33a Inhibitor轉染組和AllStars Negative Control siRNA轉染組(陰性對照組)和未處理組(空白對照組)48h后miR-33a的表達狀況,結果顯示:陰性對照組與空白對照組中miR-33a的表達沒有顯著差異(0.96±0.005 vs.1±0.020,P=0.859);miR-33a mimic轉染組胃癌SGC-7901細胞中miR-33a的表達水平較空白對照組顯著提高(434.83±9.58vs.1±0.020,P0.001)。miR-33a Inhibitor轉染組胃癌SGC-7901細胞中miR-33a的表達水平較空白對照組顯著下降(0.36±0.03 vs.1±0.020,P0.001)。提示轉染實驗成功,可進行后續(xù)實驗研究。3.miR-33a表達對人胃癌細胞株SGC-7901細胞增殖能力的影響CCK-8細胞增殖檢測顯示,SGC-7901細胞轉染48小時后,miR-33a mimic轉染組、miR-33a Inhibitor轉染組、空白對照組、AllStars Negative Control siRNA轉染組(陰性對照組)的OD值(Mean±SD)分別為0.549±0.03、1.54±0.12、1±0.09、0.953±0.06。與空白對照組相比,miR-33a mimic轉染組的SGC-7901細胞增殖顯著降低(P0.001),miR-33a Inhibitor轉染組的SGC-7901細胞增殖顯著增強(P0.001)。4.miR-33a表達對人胃癌細胞株SGC-7901細胞增殖周期的影響流式細胞儀檢測結果顯示,SGC-7901胃癌細胞轉染48小時后,miR-33a mimics轉染組的G0/G1期、S期和G2/M期的比例(Mean±SD)分別為68.30±0.85%、23.94±0.46%和7.76±0.89%;而miR-33a Inhibitor轉染組三期的比例分別為56.30±0.95%、39.43±0.55%和4.27±0.74%;陰性對照組三期的比例分別為60.94±0.88%、35.74±0.75%和3.32±0.56%。兩組之間比較G0/G1期和S期均存在顯著差異(P0.05)。轉染miR-33a的SGC-7901胃癌細胞在G1期停滯,提示miR-33在調控G1/S期轉換中起重要作用。5.miR-33a表達對人胃癌細胞株SGC-7901侵襲遷移能力的影響劃痕實驗結果顯示,miR-33a mimic轉染組、miR-33a Inhibitor轉染組和AllStars Negative Control siRNA轉染組的劃痕愈合比例(Mean±SD)分別為103.41±6.21%、95.376±6.55%和100.00±10.06%。與陰性對照組比較,miR-33a mimic和Inhibitor轉染組均無顯著統(tǒng)計學差異(P=0.253,P=0.146)。Transwell實驗結果顯示,miR-33a mimic轉染組、miR-33a Inhibitor轉染組、All Stars Negative Control siRNA轉染組24小時后每個視野下穿過細胞數(shù)(Mean±SD)為87±4.9、83±7.2、76±5.3。與陰性對照組比較,miR-33a mimic轉染組和miR-33a Inhibitor轉染組24小時后每個視野下穿過細胞數(shù)均無顯著性統(tǒng)計學差異(P=0.341,P=0.663)。小結:1.miR-33a在胃癌細胞株中的表達顯著低于正常胃粘膜上皮細胞,與胃癌組織與癌旁組織之間的表達差異一致。2.miR-33a具有抑制SGC-7901胃癌細胞增殖的作用。3.miR-33a轉染SGC-7901胃癌細胞在G1期停滯,提示miR-33a在調控G1/S期轉換中起重要作用。4.miR-33a調控對SGC-7901胃癌細胞的侵襲遷移能力無顯著影響。第三部分miR-33a對預測靶基因PIM1/CCND1/CDK6/P53的調控機制目的:研究miR-33a對預測靶基因PIM1/CCND1/CDK6/P53的調控作用,明確miR-33a在胃癌細胞增殖功能中調控通路和機制。方法:運用MicroRNA生物信息學網站和軟件,結合miR-33a對胃癌細胞增殖功能的影響,預測和篩選可能的作用靶序列。通過雙熒光素酶報告基因分析的方法檢測miR-33a對其預測靶基因靶向作用;采用qRT-PCR和Western-blot檢測轉染miR-33a mimic和Inhibitor的胃癌細胞株SGC-7901中預測靶基因CDK6、CCND和PIM1的表達變化;并通過檢測胃癌組織和配對癌旁組織中靶基因的表達,進一步驗證miR-33a與靶基因表達的關系。結果:1.生物信息學預測Hsa-miR-33a的目標靶基因。通過在線生物信息學網站FindTar 3.0數(shù)據庫,同時結合miRBase,miRanda,PicTar等數(shù)據庫的檢索結果,本研究推測篩選出CCND1、CDK6、PIM1和P53作為miR-33a調控細胞增殖的潛在預測靶基因。2.雙熒光素酶報告系統(tǒng)對miR-33a預測靶基因CCND1、CDK6、PIM1和P53的驗證。雙熒光素酶報告基因分析顯示,與AllStars Negative Control siRNA轉染組(陰性對照組)相比較,miR-33a mimics轉染組可顯著降低PIM1(0.78±0.03 vs.0.97±0.33,P0.05)、CCND1(0.56±0.01 vs.0.98±0.05,P0.01)和CDK6的相對熒光強度(0.45±0.01 vs.1.05±0.03,P0.01),而P53的相對熒光強度無明顯變化(0.87±0.06 vs.1.04±0.03,P=0.138)。提示在胃癌細胞中PIM1、CCND1、CDK6基因是miR-33a靶基因,而P53并不是miR-33a的靶基因。3.調控胃癌細胞SGC-7901中miR-33a表達對靶基因CCND1、CDK6和PIM1表達的影響。miR-33a mimic轉染SGC-7901胃癌細胞后,CDK6、CCND1和PIM1的mRNA表達水平較陰性對照組均顯著降低(0.18±0.01 vs.1.10±0.03,P0.01;0.21±0.02 vs.0.94±0.09,P0.01;0.43±0.09 vs.0.95±0.08,P0.01);反之,轉染miR-33a抑制物的SGC-7901胃癌細胞的CDK6、CCND1和PIM1的mRNA的表達水平較陰性對照組均顯著升高(3.24±0.17 vs.1.10±0.03,P0.01;1.97±0.14 vs.0.94±0.09,P0.01;2.13±0.11 vs.0.95±0.08,P0.01)。同樣,miR-33a mimic轉染SGC-7901胃癌細胞后,CDK6、CCND1和PIM1的蛋白表達水平較陰性對照組均顯著降低;而轉染miR-33a抑制物的SGC-7901胃癌細胞的CDK6、CCND1和PIM1的蛋白表達水平較陰性對照組均顯著升高。4.CDK6、CCND1、PIM1和P53在胃癌組織中表達及其與miR-33a表達的相關性。與癌旁組織相比較,49.1%(28/57),54.4%(31/57),68.4%(39/57)和68.4%(39/57)的胃癌組織中存在CDK6、CCND1、PIM1和P53 mRNA表達的上調。胃癌組織中PIM和P53的mRNA表達水平顯著高于癌旁組織(P=0.004;P=0.039);而CDK6和CCND1的mRNA表達水平無顯著統(tǒng)計學差異(P=0.429;P=0.467)。mi R-33a表達與CDK6、CCND1和PIM1的表達呈顯著負相關(r=-0.282,P=0.033;r=-0.353,P=0.010;r=-0.323,P=0.014);與P53表達無顯著相關性(r=-0.095,P=0.482)。小結:1.CDK6、CCND1和PIM1是胃癌中miR-33a調控的靶基因。2.miR-33a可通過靶向抑制CDK6、CCND1和PIM1的表達,調控細胞周期,抑制胃癌細胞增殖。結論:1.miR-33a在胃癌組織中表達較癌旁組織顯著下降;miR-33b在胃癌組織中表達與癌旁組織無顯著差異;miR-33a表達與胃癌患者的腫瘤組織分化程度、遠處轉移及外周血中CA-199的水平呈顯著負相關;與miR-33a低表達患者相比較,miR-33高表達胃癌術后患者的DFS顯著延長。2.miR-33a在胃癌細胞株中的表達顯著低于正常胃粘膜上皮細胞;miR-33a具有抑制胃癌細胞增殖的作用;miR-33a可調控SGC-7901胃癌細胞增殖周期,將細胞周期阻滯于G1期,從而抑制胃癌細胞增殖;miR-33a表達變化對SGC-7901胃癌細胞的侵襲遷移能力無顯著影響。3.CDK6、CCND1和PIM1是miR-33a的靶基因;miR-33a可通過抑制CDK6、CCND1和PIM1的表達,調控細胞周期,抑制胃癌細胞增殖。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.2
【圖文】：

32圖１胃癌組織(A)與癌旁組織(B)的 HE 染色(200×)toxylin-eosin staining analysis of gastric cancer tissuadjacent tissues (B) (200×)

圖 2 胃癌組織與匹配癌旁組織 miR-33a 表達差異（qRT-P qRT-PCR analysis of gastric cancer tissues and paired adjaceng significantly decreased miR-33a expression in gastric cancThe paired adjacent tissues expression was 100.511.522.531 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 5

4 胃癌組織與匹配癌旁組織 miR-33b 表達差異（qRT-PCR）RT-PCR analysis of gastric cancer tissues and paired adjacent tg significantly decreased miR-33b expression in gastric cancer The paired adjacent tissues expression was 1

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本文編號：2779959