【摘要】：目的:胃癌(Gastric Cancer,GC)作為一種惡性消化道腫瘤,嚴(yán)重危害人類生命健康,加強(qiáng)對胃癌病因?qū)W及發(fā)病機(jī)制的研究,對胃癌的預(yù)防和早期診治具有重要的意義。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)在胃癌的發(fā)生和進(jìn)展中起著舉足輕重的作用,EMT可使胃癌細(xì)胞間的黏附能力減弱,促進(jìn)胃癌細(xì)胞脫落、并賦予其遷移能力,從而使胃癌細(xì)胞產(chǎn)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)在腫瘤生長中扮演重要角色,在早期腫瘤中限制上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的繁殖,但在晚期腫瘤中激活EMT,加速腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。miRNA-181家族在多種惡性腫瘤(乳腺癌、肺癌、肝癌、血液病、胰腺癌、胃癌及膠質(zhì)瘤等)的增殖、分化、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移及化療耐藥中扮演重要角色。其中miRNA-181b在胃癌中過表達(dá),miRNA-181b也與以BCL2為靶點(diǎn)的多重耐藥相關(guān)。但是,TGF-β誘導(dǎo)的miRNA-181b在胃癌發(fā)生與轉(zhuǎn)移過程中扮演角色的潛在機(jī)制尚未被徹底闡明。并且在TGF-β誘導(dǎo)的EMT過程中,miRNA-181b的直接靶基因仍尚未被識別。因此,本研究旨在明確miRNA-181b及其直接作用靶點(diǎn)和TGF-β-Smad2/3/4通路與胃癌EMT表型之間的關(guān)系。方法:本研究選用人胃癌細(xì)胞株(MKN-28、SGC-7901、HGC-27和AGS),通過劃痕實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞侵襲等實(shí)驗(yàn),探究TGF-β調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)行為的能力。通過轉(zhuǎn)染使用miRNA-181b類似物和抑制劑來調(diào)控miRNA的表達(dá)及對胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。通過免疫熒光及激光共聚焦檢測胃癌細(xì)胞骨架蛋白F-actin評估胃癌細(xì)胞形態(tài)變化。miRNA-181b,EMT標(biāo)記基因及miRNA-181b潛在靶基因等的表達(dá)由實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測分析。利用免疫印跡法(Western Blot)分析磷酸化Smad2和Smad4水平。構(gòu)建含Smad4特異性siRNA序列的慢病毒載體,并篩選獲得Smad4穩(wěn)定敲減的胃癌細(xì)胞株。利用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miRNA-18lb與Timp3的直接結(jié)合。構(gòu)建Timp3過表達(dá)穩(wěn)定表達(dá)胃癌細(xì)胞株進(jìn)行回復(fù)實(shí)驗(yàn)。最后通過Balb/cNOD荷瘤小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miRNA-181b-Timp3通路對胃癌細(xì)胞增殖和遷移的作用。結(jié)果:TGF-β刺激能顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移(HGC-27:P=0.014;AGS:P=0.021),侵襲能力(HGC-27:P=0.002;AGS:P=0.011)以及EMT的發(fā)生,并且顯著上調(diào)miRNA-181b 前體(MKN-28:P=0.033;SGC-7901:P=0.008;HGC-27:P=0.004;AGS:P=0.003)及成熟體(MKN-28:P=0.041;SGC-7901:P=0.003;HGC-27:P=0.009;AGS:P=0.005)在胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)。miRNA-181b類似物的過表達(dá)在體外誘導(dǎo)了胃癌細(xì)胞的EMT樣改變,其表型與單用TGF-β誘導(dǎo)的EMT效應(yīng)類似,且可被miRNA-181b抑制劑逆轉(zhuǎn)(HGC-27:P=0.036;AGS:P=0.024)。使用 TGF-β RⅠ/Ⅱ 特異性抑制劑 SD-208阻滯TGF-β-Smad2/3信號通路,可顯著抑制TGF-β誘導(dǎo)的miRNA-181b前體(HGC-27:P=0.037;AGS:P=0.006)和成熟體(HGC-27:P=0.017;AGS:P=0.012)的上調(diào)。抑制Smad4基因同樣可顯著抑制胃癌細(xì)胞株中TGF-β誘導(dǎo)的miRNA-181b前體(HGC-27:P=0.042;AGS:P=0.036)和成熟體(HGC-27:P=0.039;AGS:P=0.021)的上調(diào)。miRNA-181b直接靶向作用于Timp3 mRNA的3'-非翻譯區(qū)(3'UTR),抑制Timp3的表達(dá),影響TGF-β誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的EMT過程。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),miRNA-181b-Timp3通路對于胃癌細(xì)胞的增殖無顯著作用,但是顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移能力(P=0.021)。結(jié)論:上述結(jié)果揭示了 TGF-β通路調(diào)控胃癌細(xì)胞EMT發(fā)生的新機(jī)制,即TGF-β經(jīng)由依賴Smad2/3/4的通路,轉(zhuǎn)錄激活miRNA-181b水平,miRNA-181b靶向抑制Timp3的表達(dá),誘導(dǎo)EMT發(fā)生。該發(fā)現(xiàn)揭示了腫瘤細(xì)胞微環(huán)境調(diào)控EMT的新機(jī)制,有望指導(dǎo)將來針對此類機(jī)制的靶向治療研究。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.2
【圖文】：

邐ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ參與ＴＧＦ－（３誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究逡逑侵襲能力的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ＴＧＦ－Ｐ刺激顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，見圖１－１。逡逑Ｂｌａｎｋ邐ＴＧＦ－ｐ邐Ｂｌａｎｋ逡逑k酬逡逑圖１－１．邋Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ法檢測ＴＧＦ－ｐ刺激（５邋ｎｇ／ｍｌ，邋２４小時(shí)）前后人胃癌細(xì)胞ＨＧＣ－２７，邋ＡＧＳ細(xì)胞株逡逑的侵襲能力差異。＊戶＜0．0５，＊＊Ｐ＜０．０１比對照組。逡逑２．

為了探索ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ與ＴＧＦ－ｐ刺激的關(guān)系，我們利用ＴＧＦ－Ｐ邋（５邋ｎｇ／ｍｌ）時(shí)間梯度逡逑（０、１２、２４、４８小時(shí)）刺激人胃癌細(xì)胞株ＭＫＮ－２８，ＳＧＣ－７９０１，ＨＧＣ－２７和ＡＧＳ細(xì)胞逡逑株，通過實(shí)時(shí)熒光定量ＰＣＲ實(shí)驗(yàn)檢測ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ前體及成熟體的表達(dá)量，如圖１－４逡逑所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ＴＧＦ－ｐ刺激１２小時(shí)后，僅有ＳＧＣ－７９０１細(xì)胞中ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ成熟體升逡逑高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其余三株無顯著改變；ＴＧＦ－卩刺激２４小時(shí)后，ＳＧＣ－７９０１，ＡＧＳ逡逑和ＨＧＣ－２７三株細(xì)胞中ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ前體和成熟體的表達(dá)量均顯著升高；ＴＧＦ－ｐ刺激逡逑４８小時(shí)后，四株胃癌細(xì)胞中ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ前體和成熟體的表達(dá)量均顯著升高。結(jié)果提逡逑示，ＴＧＦ－ｐ刺激可以顯著激活ｍｉＲＮＡ－１８ｌｂ的轉(zhuǎn)錄水平，但是目前關(guān)于ＴＧＦ－ｐ激活逡逑ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ的轉(zhuǎn)錄水平尚未在胃癌中發(fā)現(xiàn)，并且ＴＧＦ－Ｐ通過何種機(jī)制調(diào)控逡逑ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ的轉(zhuǎn)錄激活，目前尚不清楚，為了闡明此問題，我們將后續(xù)進(jìn)一步進(jìn)行逡逑探索。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑Ｃ逡逑0逡逑．１邐Ｓ逡逑巴邋６邐口邋０邋ｈｏｕｒ邋ｇ－邋６邐ｒ邋？？邋，邐□邋０邋ｈｏｕｒ逡逑＾邐１邋□邋１２邋ｈｏｕｒｓ邋ｎ邐N邐ｉ—＾邋0邋１２邋ｈｏｕｒｓ逡逑５邋§邋４－邐＾邋０邋２４邋ｈｏｕｒｓ邋ｊ邋§邋４．邐２４邋ｈｏｕｒｓ逡逑Ｊ邋ｗ邐■邋Ｉ邋Ａ邋■邋４８邋ｈｏｕｒｓ邋ｚ邋＾邐

圖１－３．實(shí)時(shí)熒光定量ＰＣＲ實(shí)驗(yàn)檢測ＴＧＦ－ｐ刺激（５邋ｎｇ／ｍｌ，２４小時(shí)）前后人胃癌細(xì)胞ＨＧＣ－２７逡逑（Ａ），ＡＧＳ邋＜Ｂ）細(xì)胞株中邋ＥＭＴ邋指標(biāo)（Ｅ－ｃａｄｔ＇ｈｅｒｉｎ，Ｖｉｍｅｎｔｉｎ，邋Ｚｅｂｌ邋和邋Ｓｎａｉｌｌ）的表達(dá)差異。＊／＞＜０．０５，逡逑＊＊Ｐ＜０．０丨比對照組。逡逑為了探索ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ與ＴＧＦ－ｐ刺激的關(guān)系，我們利用ＴＧＦ－Ｐ邋（５邋ｎｇ／ｍｌ）時(shí)間梯度逡逑（０、１２、２４、４８小時(shí)）刺激人胃癌細(xì)胞株ＭＫＮ－２８，ＳＧＣ－７９０１，ＨＧＣ－２７和ＡＧＳ細(xì)胞逡逑株，通過實(shí)時(shí)熒光定量ＰＣＲ實(shí)驗(yàn)檢測ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ前體及成熟體的表達(dá)量，如圖１－４逡逑所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ＴＧＦ－ｐ刺激１２小時(shí)后，僅有ＳＧＣ－７９０１細(xì)胞中ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ成熟體升逡逑高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其余三株無顯著改變；ＴＧＦ－卩刺激２４小時(shí)后，ＳＧＣ－７９０１，ＡＧＳ逡逑和ＨＧＣ－２７三株細(xì)胞中ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ前體和成熟體的表達(dá)量均顯著升高；ＴＧＦ－ｐ刺激逡逑４８小時(shí)后，四株胃癌細(xì)胞中ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ前體和成熟體的表達(dá)量均顯著升高。結(jié)果提逡逑示，ＴＧＦ－ｐ刺激可以顯著激活ｍｉＲＮＡ－１８ｌｂ的轉(zhuǎn)錄水平，但是目前關(guān)于ＴＧＦ－ｐ激活逡逑ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ的轉(zhuǎn)錄水平尚未在胃癌中發(fā)現(xiàn)，并且ＴＧＦ－Ｐ通過何種機(jī)制調(diào)控逡逑ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ的轉(zhuǎn)錄激活，目前尚不清楚，為了闡明此問題，我們將后續(xù)進(jìn)一步進(jìn)行逡逑探索。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑Ｃ逡逑

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