【摘要】：雄激素受體(Androgen receptor,AR)是I型核受體家族成員,在男性性特征發(fā)育及表型維持中發(fā)揮著重要的作用。在雄激素的不存在的情況下,雄激素受體處于非激活狀態(tài)與熱啟動(dòng)蛋白相互作用定位于細(xì)胞質(zhì)中,在雄激素的作用下,雄激素受體發(fā)生構(gòu)象改變,形成二聚體進(jìn)而轉(zhuǎn)入細(xì)胞核中,激活靶基因的表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞增殖,分化等生理活動(dòng),這樣的通路被認(rèn)為是雄激素受體經(jīng)典通路,也稱為基因組雄激素受體通路。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)雄激素受體可以在幾分鐘內(nèi)快速的應(yīng)答雄激素受體,而這種快速的應(yīng)答不依賴于雄激素受體的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移,不依賴于靶基因的表達(dá),因而把這樣一種雄激素受體通路稱為非基因組雄激素受體通路。通過(guò)非基因組雄激素受體通路,雄激素受體可以激活PI3K-AKT,ERK,Src等信號(hào)傳導(dǎo)通路等。近來(lái)隨著對(duì)雄激素受體非基因組功能研究的深入,科研人員發(fā)現(xiàn)AR除了發(fā)生細(xì)胞核轉(zhuǎn)移,同時(shí)AR也可在雄激素的作用下發(fā)生快速的細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移,而這種AR的細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移與PI3K-AKT的激活相關(guān),干擾AR的細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移,抑制AKT的磷酸化與激活,暗示AR的細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移可能對(duì)AR的功能有著重要意義。有研究認(rèn)為AR的細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移與caveolin-1蛋白相關(guān),過(guò)表達(dá)caveolin-1可檢測(cè)到更多的AR轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)膜,但多數(shù)前列腺癌細(xì)胞系中,AR與caveolin-1并不存在共表達(dá),暗示表達(dá)caveolin-1可能參與協(xié)助AR的細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移,但該轉(zhuǎn)移并不依賴于caveolin-1。目前對(duì)于AR具體是通過(guò)何種方式轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)膜并不是很清楚。相反AR的細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制研究較為明確,AR與動(dòng)力蛋白dynein結(jié)合通過(guò)微管依賴的模式轉(zhuǎn)移至近核端,隨后依賴于Importinα/β介導(dǎo)的通路完成入核過(guò)程。那么AR的細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移過(guò)程又是如何呢,是否也依賴于微管呢?是否也需要馬達(dá)蛋白相互作用進(jìn)而通過(guò)微管轉(zhuǎn)運(yùn)呢?同時(shí)AR轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)膜后,除了激活PI3K-AKT通路還參加哪些細(xì)胞生理過(guò)程呢?針對(duì)以上未知問(wèn)題,本論文首先通過(guò)免疫熒光和細(xì)胞質(zhì)膜組分分離手段,證明了在雄激素的作用下,AR可以發(fā)生快速的細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移,通過(guò)雄激素受體拮抗劑可有效的抑制AR的細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移,進(jìn)一步說(shuō)明中AR的細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移由雄激素誘導(dǎo)。通過(guò)蔗糖密度梯度離心的方式,我們對(duì)AR的細(xì)胞質(zhì)膜定位進(jìn)行了定量分析,發(fā)現(xiàn)雄激素作用20分鐘的條件下,8%左右的AR轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)膜,充分證明了在雄激素作用下AR可發(fā)生快速的細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步,本論文發(fā)現(xiàn)使用微管靶向藥物多西紫杉醇(抑制微管解聚)或諾考達(dá)唑(抑制微管穩(wěn)定)均可抑制AR的細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移,而通過(guò)細(xì)胞松弛素D干擾微絲的功能對(duì)AR的細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移沒(méi)有作用,證明了AR的細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移依賴于微管但并不依賴于微絲。進(jìn)一步探究本論文發(fā)現(xiàn)KIF5B作為驅(qū)動(dòng)蛋白介導(dǎo)了AR依賴于微管的運(yùn)輸,通過(guò)dominant-negative mutant或者siRNA敲除KIF5B,均抑制了AR的細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移。同時(shí)干擾KIF5B的功能也抑制了下游AKT的激活,證明了KIF5B參與AR的細(xì)胞質(zhì)膜運(yùn)輸。如果KIF5B是以驅(qū)動(dòng)蛋白的形式參與AR運(yùn)輸,那么AR與KIF5B之間一定存在相互作用,通過(guò)免疫沉淀實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)AR與KIF5B存在相互作用,同時(shí)雄激素可以誘導(dǎo)AR與KIF5B之間作用加強(qiáng)。通過(guò)構(gòu)建不同AR功能結(jié)構(gòu)域的缺失,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)AR是通過(guò)N端結(jié)構(gòu)域參與與KIF5B的相互作用,基于以上實(shí)驗(yàn),充分說(shuō)明了驅(qū)動(dòng)蛋白KIF5B介導(dǎo)了AR的細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移。棕櫚酰化修飾對(duì)于蛋白質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)膜定位有重要意義,固醇類核受體家族成員均可發(fā)生棕櫚�；揎�,AR的棕櫚酰化修飾發(fā)生在第807位半胱氨酸,通過(guò)使用2-bromopalmitate特異性抑制AR的棕櫚�；揎椈蛘咄蛔兤渥貦磅；稽c(diǎn)(AR-C807A)可有效的抑制AR的細(xì)胞質(zhì)膜定位,但不能影響AR與KIF5B的結(jié)合,暗示棕櫚�；揎椏赡軈⒓覣R的細(xì)胞質(zhì)膜錨定,但并不參與AR向細(xì)胞質(zhì)膜運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程。進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜定位的AR的進(jìn)行功能研究,發(fā)現(xiàn)干擾AR細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移抑制了AR對(duì)靶基因的調(diào)控,減弱了雄激素作用下AR對(duì)PSA和TMRPSS2的mRNA的誘導(dǎo)作用,通過(guò)免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)AR-C807A(細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移缺失AR)不僅不能定位于細(xì)胞質(zhì)膜,在雄激素作用下其細(xì)胞核轉(zhuǎn)移速率也受到了抑制,應(yīng)用細(xì)胞核質(zhì)蛋白分離手段,進(jìn)一步確認(rèn)了在雄激素作用下AR-C807A具有較慢的入核速率。以上實(shí)驗(yàn)說(shuō)明了8%發(fā)生細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移的AR可以調(diào)控其余AR的入核過(guò)程,調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性,調(diào)節(jié)其基因組功能。野生型的AR在雄激素的作用下可以快速誘導(dǎo)HSP27的磷酸化,磷酸化的HSP27隨后可與AR結(jié)合,協(xié)助AR的快速入核,本論文發(fā)現(xiàn)AR-C807A在雄激素的作用下不能誘導(dǎo)HSP27的磷酸化,暗示細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移AR可能通過(guò)磷酸化HSP27,進(jìn)而調(diào)節(jié)AR的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步確認(rèn)HSP27的作用,本論文在將HSP27-mimic(磷酸化HSP27)和AR-C807A共表達(dá),發(fā)現(xiàn)HSP27-mimic可以恢復(fù)AR靶基因TMRPSS2的表達(dá),同時(shí)可以恢復(fù)部分由AR-C807A抑制的細(xì)胞增殖,充分證明了細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移AR通過(guò)激活HSP27調(diào)節(jié)AR的基因組功能,調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖,靶基因的表達(dá)�？偨Y(jié)以上實(shí)驗(yàn),本論文對(duì)AR細(xì)胞質(zhì)膜機(jī)制及其作用進(jìn)行了深入研究,發(fā)現(xiàn)了AR通過(guò)微管依賴的方式發(fā)生細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移,驅(qū)動(dòng)蛋白KIF5B通過(guò)與ARN端結(jié)構(gòu)域結(jié)合介導(dǎo)了這一轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程,發(fā)生細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移的AR可以調(diào)節(jié)AKT的激活,磷酸化HSP27,進(jìn)而調(diào)控AR的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移及其轉(zhuǎn)錄活性。以上研究為完善雄激素信號(hào)傳統(tǒng)通路提供了重要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。同時(shí)AR的細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移可以發(fā)生在極低的雄激素濃度下(去勢(shì)抵抗治療條件下)也暗示AR的細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移可能在去勢(shì)抵抗前列腺癌中發(fā)揮著重要作用,為去勢(shì)抵抗前列腺癌的治療也提供了新的分子機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.25
【圖文】：

受體（mineralocorticoid receptor，MR）22 24。雄激素受體主要表達(dá)應(yīng)答雄激素的組織中，比如前列腺，骨骼肌，肝臟和中央神經(jīng)系統(tǒng)25。雄激素受體可以被內(nèi) 源 的 雄 激 素 激 活 ， 包 括 睪 酮 （ Testosterone ） 和 5α- 雙 氫 睪 酮 （ 5α-hihydrotestosterone，DHT）。雄激素受體參與眾多生理過(guò)程，包括促進(jìn)青春期發(fā)育，參與前列腺發(fā)育與功能26 28。1.2.1 雄激素受體結(jié)構(gòu)雄激素受體基因由 X 染色體長(zhǎng)臂 q11-12 編碼，其 mRNA 約為 10.6kb，包括 8個(gè)不同的外顯子29 31。雄激素受體蛋白由 920個(gè)氨基酸組成，分子量為 110KDa，分成 4 個(gè)不同的功能結(jié)構(gòu)域，包括 N 端結(jié)構(gòu)域（N-terminal domain，NTD ）， DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（ DNA binding domain ，DBD），Hinge 結(jié)構(gòu)域（Hinge domain）以及 C 端配體結(jié)構(gòu)域（Ligand binding domain，LBD）22,28。每個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)τ谛奂に厥荏w的功能完整性都具有重要意義。

圖 1.2 雄激素受體可變剪切Figure 1.2 Androgen receptor splice variantsEndocr. Relat. Cancer.; 23 （2016）在這 20 多種 ARVs 中，ARV7 的表達(dá)率最高，有文獻(xiàn)對(duì)去勢(shì)抵抗前列腺癌患者的血樣中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的 DNA 進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)在大于 50%的樣本中檢測(cè)到 ARV786。ARV7 的 mRNA 包括 AR 經(jīng)典的前三個(gè)外顯子，和一個(gè) V7 特異性的外顯子 CE3，CE3 表達(dá)一個(gè) 16 氨基酸的序列，該序列為 ARV7 特有的，CE3的剪切造成外顯子 4-8 無(wú)法正確剪切，因而 ARV7 缺失 C 端配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。ARV7 因缺少 C 端配體結(jié)構(gòu)域，并不能與雄激素結(jié)合，同時(shí)因其具有部分入核序列，而缺少出核序列，ARV7 無(wú)論在配體存在下或者配體缺失情況下均定位于細(xì)胞核中，同時(shí)具有持續(xù)活性。ARV7 的表達(dá)與紫杉醇類藥物抵抗相關(guān)，紫杉醇類藥物可干擾微管的結(jié)合，進(jìn)而干擾 AR 的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移過(guò)程，而研究發(fā)現(xiàn)

圖 1.3 經(jīng)典雄激素受體傳導(dǎo)通路Figure 1.3 Classical androgen receptor signaling pathwayNature Reviews Cancer, 1, 34-45, （2001）激素受體功能相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的雄激素受體通路中，AR 的功能及活性可通過(guò)與不同的被調(diào)控。在激活狀態(tài)下即 AR 與激動(dòng)劑結(jié)合狀態(tài)下，A加其轉(zhuǎn)錄活性，包括甾類激素受體共調(diào)節(jié)因子（steroidSRC）, CREB 結(jié)合蛋白（CREB binding proteins ，CBP結(jié)合因子（p/CAF）等，進(jìn)而協(xié)助高效轉(zhuǎn)錄105。表 1.4 為ctivator 及其功能。在抑制狀態(tài)下，即 AR 與拮抗劑結(jié)合狀repressor，包括 SMRT (silencing mediators of retinoic acid

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本文編號(hào)：2777343