【摘要】：雄激素受體(Androgen receptor,AR)是I型核受體家族成員,在男性性特征發(fā)育及表型維持中發(fā)揮著重要的作用。在雄激素的不存在的情況下,雄激素受體處于非激活狀態(tài)與熱啟動蛋白相互作用定位于細胞質中,在雄激素的作用下,雄激素受體發(fā)生構象改變,形成二聚體進而轉入細胞核中,激活靶基因的表達,誘導細胞增殖,分化等生理活動,這樣的通路被認為是雄激素受體經典通路,也稱為基因組雄激素受體通路。越來越多的研究發(fā)現雄激素受體可以在幾分鐘內快速的應答雄激素受體,而這種快速的應答不依賴于雄激素受體的細胞核轉移,不依賴于靶基因的表達,因而把這樣一種雄激素受體通路稱為非基因組雄激素受體通路。通過非基因組雄激素受體通路,雄激素受體可以激活PI3K-AKT,ERK,Src等信號傳導通路等。近來隨著對雄激素受體非基因組功能研究的深入,科研人員發(fā)現AR除了發(fā)生細胞核轉移,同時AR也可在雄激素的作用下發(fā)生快速的細胞質膜轉移,而這種AR的細胞質膜轉移與PI3K-AKT的激活相關,干擾AR的細胞質膜轉移,抑制AKT的磷酸化與激活,暗示AR的細胞質膜轉移可能對AR的功能有著重要意義。有研究認為AR的細胞質膜轉移與caveolin-1蛋白相關,過表達caveolin-1可檢測到更多的AR轉移至細胞質膜,但多數前列腺癌細胞系中,AR與caveolin-1并不存在共表達,暗示表達caveolin-1可能參與協助AR的細胞質膜轉移,但該轉移并不依賴于caveolin-1。目前對于AR具體是通過何種方式轉移至細胞質膜并不是很清楚。相反AR的細胞核轉運的機制研究較為明確,AR與動力蛋白dynein結合通過微管依賴的模式轉移至近核端,隨后依賴于Importinα/β介導的通路完成入核過程。那么AR的細胞質膜轉移過程又是如何呢,是否也依賴于微管呢?是否也需要馬達蛋白相互作用進而通過微管轉運呢?同時AR轉移至細胞質膜后,除了激活PI3K-AKT通路還參加哪些細胞生理過程呢?針對以上未知問題,本論文首先通過免疫熒光和細胞質膜組分分離手段,證明了在雄激素的作用下,AR可以發(fā)生快速的細胞質膜轉移,通過雄激素受體拮抗劑可有效的抑制AR的細胞質膜轉移,進一步說明中AR的細胞質膜轉移由雄激素誘導。通過蔗糖密度梯度離心的方式,我們對AR的細胞質膜定位進行了定量分析,發(fā)現雄激素作用20分鐘的條件下,8%左右的AR轉移至細胞質膜,充分證明了在雄激素作用下AR可發(fā)生快速的細胞質膜轉移。進一步,本論文發(fā)現使用微管靶向藥物多西紫杉醇(抑制微管解聚)或諾考達唑(抑制微管穩(wěn)定)均可抑制AR的細胞質膜轉移,而通過細胞松弛素D干擾微絲的功能對AR的細胞質膜轉移沒有作用,證明了AR的細胞質膜轉移依賴于微管但并不依賴于微絲。進一步探究本論文發(fā)現KIF5B作為驅動蛋白介導了AR依賴于微管的運輸,通過dominant-negative mutant或者siRNA敲除KIF5B,均抑制了AR的細胞質膜轉移。同時干擾KIF5B的功能也抑制了下游AKT的激活,證明了KIF5B參與AR的細胞質膜運輸。如果KIF5B是以驅動蛋白的形式參與AR運輸,那么AR與KIF5B之間一定存在相互作用,通過免疫沉淀實驗,發(fā)現AR與KIF5B存在相互作用,同時雄激素可以誘導AR與KIF5B之間作用加強。通過構建不同AR功能結構域的缺失,進一步發(fā)現AR是通過N端結構域參與與KIF5B的相互作用,基于以上實驗,充分說明了驅動蛋白KIF5B介導了AR的細胞質膜轉移。棕櫚酰化修飾對于蛋白質的細胞質膜定位有重要意義,固醇類核受體家族成員均可發(fā)生棕櫚�；揎�,AR的棕櫚酰化修飾發(fā)生在第807位半胱氨酸,通過使用2-bromopalmitate特異性抑制AR的棕櫚�；揎椈蛘咄蛔兤渥貦磅；稽c(AR-C807A)可有效的抑制AR的細胞質膜定位,但不能影響AR與KIF5B的結合,暗示棕櫚�；揎椏赡軈⒓覣R的細胞質膜錨定,但并不參與AR向細胞質膜運輸的過程。進一步對細胞質膜定位的AR的進行功能研究,發(fā)現干擾AR細胞質膜轉移抑制了AR對靶基因的調控,減弱了雄激素作用下AR對PSA和TMRPSS2的mRNA的誘導作用,通過免疫熒光技術發(fā)現AR-C807A(細胞質膜轉移缺失AR)不僅不能定位于細胞質膜,在雄激素作用下其細胞核轉移速率也受到了抑制,應用細胞核質蛋白分離手段,進一步確認了在雄激素作用下AR-C807A具有較慢的入核速率。以上實驗說明了8%發(fā)生細胞質膜轉移的AR可以調控其余AR的入核過程,調節(jié)其轉錄活性,調節(jié)其基因組功能。野生型的AR在雄激素的作用下可以快速誘導HSP27的磷酸化,磷酸化的HSP27隨后可與AR結合,協助AR的快速入核,本論文發(fā)現AR-C807A在雄激素的作用下不能誘導HSP27的磷酸化,暗示細胞質膜轉移AR可能通過磷酸化HSP27,進而調節(jié)AR的細胞核轉移。進一步確認HSP27的作用,本論文在將HSP27-mimic(磷酸化HSP27)和AR-C807A共表達,發(fā)現HSP27-mimic可以恢復AR靶基因TMRPSS2的表達,同時可以恢復部分由AR-C807A抑制的細胞增殖,充分證明了細胞質膜轉移AR通過激活HSP27調節(jié)AR的基因組功能,調節(jié)細胞增殖,靶基因的表達�？偨Y以上實驗,本論文對AR細胞質膜機制及其作用進行了深入研究,發(fā)現了AR通過微管依賴的方式發(fā)生細胞質膜轉移,驅動蛋白KIF5B通過與ARN端結構域結合介導了這一轉運過程,發(fā)生細胞質膜轉移的AR可以調節(jié)AKT的激活,磷酸化HSP27,進而調控AR的細胞核轉移及其轉錄活性。以上研究為完善雄激素信號傳統通路提供了重要的實驗數據。同時AR的細胞質膜轉移可以發(fā)生在極低的雄激素濃度下(去勢抵抗治療條件下)也暗示AR的細胞質膜轉移可能在去勢抵抗前列腺癌中發(fā)揮著重要作用,為去勢抵抗前列腺癌的治療也提供了新的分子機制。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.25
【圖文】：

受體（mineralocorticoid receptor，MR）22 24。雄激素受體主要表達應答雄激素的組織中，比如前列腺，骨骼肌，肝臟和中央神經系統25。雄激素受體可以被內 源 的 雄 激 素 激 活 ， 包 括 睪 酮 （ Testosterone ） 和 5α- 雙 氫 睪 酮 （ 5α-hihydrotestosterone，DHT）。雄激素受體參與眾多生理過程，包括促進青春期發(fā)育，參與前列腺發(fā)育與功能26 28。1.2.1 雄激素受體結構雄激素受體基因由 X 染色體長臂 q11-12 編碼，其 mRNA 約為 10.6kb，包括 8個不同的外顯子29 31。雄激素受體蛋白由 920個氨基酸組成，分子量為 110KDa，分成 4 個不同的功能結構域，包括 N 端結構域（N-terminal domain，NTD ）， DNA 結合結構域（ DNA binding domain ，DBD），Hinge 結構域（Hinge domain）以及 C 端配體結構域（Ligand binding domain，LBD）22,28。每個結構域對于雄激素受體的功能完整性都具有重要意義。

圖 1.2 雄激素受體可變剪切Figure 1.2 Androgen receptor splice variantsEndocr. Relat. Cancer.; 23 （2016）在這 20 多種 ARVs 中，ARV7 的表達率最高，有文獻對去勢抵抗前列腺癌患者的血樣中循環(huán)腫瘤細胞的 DNA 進行提取，發(fā)現在大于 50%的樣本中檢測到 ARV786。ARV7 的 mRNA 包括 AR 經典的前三個外顯子，和一個 V7 特異性的外顯子 CE3，CE3 表達一個 16 氨基酸的序列，該序列為 ARV7 特有的，CE3的剪切造成外顯子 4-8 無法正確剪切，因而 ARV7 缺失 C 端配體結合結構域。ARV7 因缺少 C 端配體結構域，并不能與雄激素結合，同時因其具有部分入核序列，而缺少出核序列，ARV7 無論在配體存在下或者配體缺失情況下均定位于細胞核中，同時具有持續(xù)活性。ARV7 的表達與紫杉醇類藥物抵抗相關，紫杉醇類藥物可干擾微管的結合，進而干擾 AR 的細胞核轉移過程，而研究發(fā)現

圖 1.3 經典雄激素受體傳導通路Figure 1.3 Classical androgen receptor signaling pathwayNature Reviews Cancer, 1, 34-45, （2001）激素受體功能相關轉錄調節(jié)蛋白的雄激素受體通路中，AR 的功能及活性可通過與不同的被調控。在激活狀態(tài)下即 AR 與激動劑結合狀態(tài)下，A加其轉錄活性，包括甾類激素受體共調節(jié)因子（steroidSRC）, CREB 結合蛋白（CREB binding proteins ，CBP結合因子（p/CAF）等，進而協助高效轉錄105。表 1.4 為ctivator 及其功能。在抑制狀態(tài)下，即 AR 與拮抗劑結合狀repressor，包括 SMRT (silencing mediators of retinoic acid

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4 何e

本文編號：2777343