發(fā)布時間：2020-08-01 09:44

【摘要】：研究背景和目的肝癌發(fā)病率位居我國消化道腫瘤之首,死亡率位于所有惡性腫瘤第三位。雖然近年來在臨床手術(shù)切除、放化療和靶向治療等方面有了明顯的提高,但遠(yuǎn)期生存率仍不理想。因此,探討肝癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制對開發(fā)新的治療位點和提高治療水平具有重要意義。肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程是一個錯綜復(fù)雜的、受多個基因和多個細(xì)胞信號通路調(diào)控的過程。在眾多調(diào)控因子中,microRNA(miRNA)成為近年來研究的熱點。大量的研究報道證實miR-33b表達(dá)失衡與多種疾病密切相關(guān),尤其是腫瘤的發(fā)生發(fā)展,然而有關(guān)miR-33b參與肝癌發(fā)病機制的報道較少,其在肝癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用機制尚不明確。因此,本研究擬檢測肝癌中miR-33b的表達(dá)水平,探討其在腫瘤細(xì)胞中的生物學(xué)功能,試圖為明確肝癌的發(fā)病機制及尋找新的治療靶點提供科學(xué)依據(jù)。第一章肝癌組織和細(xì)胞系中miR-33b的表達(dá)水平分析目的觀察miR-33b在肝癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)情況,為下一步探討靶基因及進行功能研究奠定基礎(chǔ)。方法收集50組肝癌及配對的癌旁組織標(biāo)本,qRT-PCR法檢測miR-33b表達(dá);選取肝癌細(xì)胞株BEL7402,PLC/PRF/5,SMMC7721,MHCC97H和人正常肝細(xì)胞HL-7702,qRT-PCR法檢測腫瘤細(xì)胞中miR-33b表達(dá)水平。結(jié)果與癌旁組織相比,大多數(shù)肝癌組織中miR-33b表達(dá)明顯下調(diào);和正常肝細(xì)胞 HL-7702 相比,肝癌細(xì)胞株 BEL7402,PLC/PRF/5,SMMC7721 和 MHCC97H中miR-33b亦表達(dá)降低。結(jié)論和正常對照組相比,miR-33b在肝癌組織和肝癌細(xì)胞中均表達(dá)下調(diào)。第二章 miR-33b靶基因Fli-1鑒定及Fli-1生物學(xué)行為探討目的預(yù)測并驗證miR-33b作用的靶基因;探討Fli-1在肝癌中的生物學(xué)行為。方法通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-33b的可能靶基因,克隆含有miR-33b和靶基因結(jié)合位點的序列至pmiRGLO載體上,分別構(gòu)建pmiRGLO-Fli-l-3'UTR載體(wt)和pmiRGLO-Fli-l-3'UTR堿基突變載體(mut)。利用熒光素酶基因報告法、qRT-PCR及western blot等實驗對靶基因進行驗證;qRT-PCR及western blot法檢測Fli-1在肝癌組織和肝癌細(xì)胞株中的表達(dá),分析其與肝癌患者的臨床病理相關(guān)性;通過克隆平板實驗、劃痕實驗及Transwell實驗檢測Fli-1對肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響。結(jié)果生物信息學(xué)預(yù)測Fli-1為miR-33b潛在的靶基因;雙熒光素酶基因報告實驗結(jié)果顯示:和陰性對照(NC)組對比,pmirGLO-Fli-13'UTR(wt)和miR-33b mimic共轉(zhuǎn)染后能有效抑制熒光素酶活性,而對結(jié)合位點進行堿基突變后,熒光素酶活性和對照組相比無明顯改變;qRT-PCR結(jié)果顯示,與NC組Fli-1 mRNA表達(dá)量相比,轉(zhuǎn)染miR-33b mimic組無明顯變化;western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-33b mimic轉(zhuǎn)染組Fli-1蛋白表達(dá)明顯下調(diào);Fli-1在肝癌組織和肝癌細(xì)胞株中表達(dá)上調(diào),并和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān);和NC組相比,Fli-1過表達(dá)組肝癌細(xì)胞的克隆形成能力顯著增加,遷徙及侵襲能力明顯增強;Fli-1敲減組,肝癌細(xì)胞的克隆形成能力變?nèi)?遷徙及侵襲能力亦出現(xiàn)下調(diào)。結(jié)論Fli-1為miR-33b的直接靶基因,Fli-1在肝癌中發(fā)揮癌基因功能。第三章miR-33b在肝癌中的生物學(xué)功能及分子機制研究目的檢測miR-33b對肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響;探討miR-33b在肝癌中發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的分子機制。方法在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-33b mimic和pcDNA3.1-Fli-1分別上調(diào)肝癌細(xì)胞中miR-33b和Fli-1表達(dá);應(yīng)用CCK-8法檢測miR-33b對肝癌細(xì)胞增殖的影響;克隆平板形成實驗檢測miR-33b對肝癌細(xì)胞克隆形成能力的影響;劃痕實驗檢測miR-33b對肝癌細(xì)胞遷移能力的影響;Transwell實驗檢測miR-33b對肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響;western blot法檢測MMP2的表達(dá)變化。結(jié)果在肝癌細(xì)胞株中過表達(dá)miR-33b后,肝癌細(xì)胞增殖和克隆形成能力明顯下調(diào);劃痕實驗顯示和NC組相比,肝癌細(xì)胞遷移距離變短,速度變慢;Transwell實驗顯示穿過Matrigel的細(xì)胞數(shù)目明顯減少;Western blot結(jié)果顯示MMP2表達(dá)下調(diào)。肝癌細(xì)胞中同時上調(diào)miR-33b和Fli-1表達(dá)組,和單獨上調(diào)miR-33b組相比,肝癌細(xì)胞增殖和克隆形成能力顯著增加;肝癌細(xì)胞遷移速度變快;侵襲能力亦明顯增加;MMP2表達(dá)顯著增多。結(jié)論miR-33b通過靶向下調(diào)Fli-1,進而抑制MMP2,降低肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,其在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌基因的功能。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.7
【圖文】：

１６－邋ｇｕｇｃａｉｍｇｃｕｇｉｍｇｃａｕｕｇｃ邋－３５逡逑圖１－２人ｍｉＲ－３３ｂ成熟序列逡逑２．邐ＲＮＡ濃度和純度測定逡逑肝癌臨床組織樣本和肝癌細(xì)胞系分別提�。遥危�，進行１．０％的瓊脂糖凝膠逡逑

我們首先在５０對肝癌臨床組織標(biāo)本和配對的癌旁組織中分析了邋ｍｉＲ－３３ｂ逡逑表達(dá)水平。焚光定量ＰＣＲ結(jié)果顯示：相對于癌旁組織，有３８例（３８／５０）肝癌逡逑組織中的ｍｉＲ－３３ｂ水平有不同程度的下降（圖１－５），差異有統(tǒng)計學(xué)意義逡逑（Ｐ＜０．０１），１２例（１２／５０）肝癌標(biāo)本中的ｍｉＲ－３３ｂ表達(dá)上調(diào)。逡逑為了進一步明確ｍｉＲ－３３ｂ與肝癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，隨后我們又在肝癌細(xì)逡逑胞系中檢測了邋ｍｉＲ－３３ｂ的表達(dá)情況。ｑＲＴ－ＰＣＲ結(jié)果顯示相對于人正常肝臟細(xì)胞逡逑ＨＬ－７７０２，肝癌細(xì)胞系邋ＢＥＬ７４０２，邋ＰＬＣ／ＰＲＦ／５，邋ＳＭＭＣ７７２１，ＭＨＣＣ９７Ｈ邋中邋ｍｉＲ－３３ｂ逡逑１９逡逑

第一章肝癌組織和細(xì)胞系中ｍｉＲ－３３ｂ的表達(dá)水平分析平均出現(xiàn)不同程度的下調(diào)（圖１－６）。上述結(jié)果提示ｍｉＲ－３３ｂ與肝癌切相關(guān)，在肝癌發(fā)病機制中可能發(fā)揮抑癌基因作用。逡逑

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 楊露;張楠楠;張彥婷;李慶華;許堯;朱相展;薛樂勛;關(guān)方霞;;Ets2 siRNA轉(zhuǎn)染對EC9706細(xì)胞增殖、侵襲、周期和凋亡的影響[J];鄭州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2015年04期

2 Kerstin Schütte;Christian Schulz;Alexander Link;Peter Malfertheiner;;Current biomarkers for hepatocellular carcinoma: Surveillance, diagnosis and prediction of prognosis[J];World Journal of Hepatology;2015年02期

3 陰海鑫;王斌;王芳;余佳;趙浩亮;;DNA甲基化介導(dǎo)的microRNA-33b下調(diào)及其在胃癌中的作用[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2013年10期

本文編號：2777300