【摘要】：研究背景:肺癌是目前全世界發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。近二十年來,分子靶向藥物的應(yīng)用逐漸增多,己經(jīng)成為具有表皮生長因子受體(EGFR)敏感基因突變的晚期非小細胞肺癌(NSCLC)的一線治療選擇。EGFR是NSCLC常見的癌癥驅(qū)動基因,EGFR敏感基因突變陽性是應(yīng)用酪氨酸激酶抑制劑(TKI)靶向藥物的前提。雖然EGFR基因敏感突變的晚期肺癌患者接受EGFR-TKIs治療的有效率可達到60%-80%,但大多數(shù)患者最終都會不可避免地出現(xiàn)T790M、C797S等EGFR耐藥基因突變,目前EGFR檢測主要依靠組織活檢標(biāo)本,液體活檢對肺癌靶向治療的指導(dǎo)作用,越來越受到關(guān)注。液體活檢主要包括循環(huán)腫瘤脫氧核糖核酸(ctDNA)和循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)的檢測。CTCs是由原發(fā)或轉(zhuǎn)移病灶脫落進入外周血的腫瘤細胞,其作為一種實時“液體活檢”的材料反映了腫瘤是否發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移,CTCs在肺癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤的診斷初期均能檢測到,是疾病不良預(yù)后的獨立預(yù)測因素。利用ctDNA進行EGFR突變分析的技術(shù)正在逐步進入臨床,CTCs也具有即時性、可富集性,且攜帶較ctDNA更為完整的腫瘤分子生物學(xué)信息,具有潛在更高的分子生物學(xué)檢測敏感性。為此臨床上基于CTCs的EGFR突變檢測及潛在的異質(zhì)性分析,具有重要耐藥機理和臨床靶向治療的研究價值。研究目的:本研究的目的是通過建立CTCs檢測、分離的技術(shù)平臺,檢測并分離臨床肺癌患者外周血CTCs,進行DNA提取擴增、EGFR突變的分析,并探索外周血CTCs的異質(zhì)性。研究方法:單個循環(huán)腫瘤細胞分離技術(shù)的建立。本研究將肺癌細胞系摻入全血,去除紅細胞,運用全自動磁性細胞分選儀分選摻入的細胞,陽性組分進行細胞固定,上皮標(biāo)識免疫熒光抗體進行細胞染色,CellEctor進行計數(shù)及分離細胞。臨床肺癌患者循環(huán)腫瘤細胞的臨床檢測。共入組121例肺癌患者、20例肺部良性疾病患者和20例健康志愿者(對照組),收集外周血標(biāo)本(4.5 mL)。通過用抗細胞角蛋白/抗EpCAM/抗CD45抗體和hoechst染色進行免疫細胞化學(xué)檢測,利用CellEctor進行CTCs計數(shù),并捕獲分離單個CTC。肺癌患者循環(huán)腫瘤細胞的EGFR突變分析。分離CTCs后進行核酸提取、擴增。使用擴增阻滯突變系統(tǒng)(ARMS)和數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(dPCR)等技術(shù)分析EGFR基因突變,及CTCs信息分析。研究結(jié)果:在肺癌細胞系摻入外周血的回收實驗中,選擇NCI-H2009作為摻入首選細胞,裂解紅細胞,CD326磁珠陽性分選細胞,運用丙酮進行細胞固定,雙上皮標(biāo)識的免疫熒光抗體進行細胞染色,CellEctor進行細胞計數(shù)、挑選分離。摻入細胞數(shù)分為2、5、10、20、40、100共5個梯度,摻入實驗前后共重復(fù)4次。摻入2個細胞的時候,回收率在50%-100%(平均62.5%);摻入10個細胞的時候,回收率在60%-80%(平均67.5%);摻入100個細胞的時候,回收率趨于穩(wěn)定在83%-89%(平均84%),摻入實驗的總體回收率在62.5%-84%之間。確診為肺癌的109例患者,其整體檢出率57/109(54.8%)。TNM分期IIIIV期肺癌患者CTC總體捕獲率為61.5%(56/91),而在健康志愿者中未檢測到CTC。III期和IV期患者的CTC陽性檢出率分別為25.0%(4/16)和69.3%(52/75),結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(Mann-Whitney檢驗,P=0.0081)。小細胞肺癌患者的CTC檢出數(shù)量(平均8.22)明顯高于其他病理類型的患者,腫瘤長徑與CTCs計數(shù)結(jié)果不具有統(tǒng)計學(xué)意義。在EGFR突變陽性的患者中,單個CTC水平EGFR突變檢出率較低(16.67%,2/12)。靈敏度隨著CTC數(shù)量的增加而增加。4例患者在10個細胞水平顯示與組織突變一致的EGFR突變,1例患者在CTC之間顯示明顯不一致和罕見的突變(G719X)。結(jié)論:建立了用于從血液中分離CTC的簡化技術(shù),多個CTCs分析可提高EGFR突變檢測敏感性;CTC和組織標(biāo)本中EGFR突變的檢測通常表現(xiàn)出同質(zhì)性,而CTC水平突變分析可能有助于發(fā)現(xiàn)異質(zhì)性突變,具有深入研究價值。
【學(xué)位授予單位】：北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R734.2
【圖文】：

3.5.2 200g 離心 5min，用 PBS 重懸細胞，重復(fù)洗滌細胞 2 次。3.5.3 0.2％的 Triton X-100 作用 2min，目的是給固定后的細胞膜打孔，以便免疫熒光染色（丙酮固定可省略此步驟）。3.5.4 200g 離心 5min，用 PBS 重懸細胞，洗滌細胞 2 次。3.5.5 加 1%BSA/10%山羊血清/0.3M 甘氨酸，孵育 1h，防止非特異性的蛋白結(jié)合。3.5.6 根據(jù)熒光抗體說明書，每份樣品加 CK8 熒光抗體 2ul，CK18 抗體1ul，CK19 熒光抗體 2ul，CD326（EpCAM）熒光抗體 5ul，CD45 熒光抗體5ul，4℃孵育 30min。3.5.7 加三倍體積的 DAPI 或 Hoechst 溶液， 4℃孵育 5min。3.5.8 加 PBS 5mL，200g 離心 5min，重復(fù)洗兩遍，重選細胞懸液體積至 50-100ul。3.6 循環(huán)腫瘤細胞的單細胞挑選

25圖 2 CTCs 分離實驗流程設(shè)計 摻入肺癌細胞系選擇與分離效率評估我們選擇了多種肺癌細胞系：A549、HCC827、NCI-H1975、NCI-H2009，pCAM 的表達，表達強弱依次是 NCI-H2009 >HCC827>NCI-H1975>A549是 H2009 流式細胞儀分析的結(jié)果，H2009 顯示良好的 EpCAM 表達均質(zhì)性

圖 3 A 圖為 NCI-H2009 細胞的散點圖，我們?nèi)x紅色的部分作為分析的目的細胞群。B圖左邊藍色峰為未標(biāo)記 EpCAM 熒光抗體的 NCI-H2009 細胞系，右邊綠色峰為標(biāo)志EpCAM 熒光抗體的 NCI-H2009 細胞3、 CTCs 染色方法的優(yōu)化本研究涉及到 CTCs 的檢測和后續(xù)的腫瘤分子生物學(xué)分析，本研究首先優(yōu)化了配套 CTCs 染色的關(guān)聯(lián)試劑，包括 CTCs 富集后 EpCAM 復(fù)染、CKs 染色、核染色及 CD45 染色。本研究對主要的抗體進行先期染色特異性分析。關(guān)于 EpCAM熒光抗體，我們挑選了四種，其中 GSC 抗體為本實驗室自制 抗，委托 GSC 公司添加熒光二抗，BD、SB、ABI 均采購自公司，整體上幾種抗體都不影響染色陽性結(jié)果的判斷，但 BD 公司的抗體 CF594 Mouse Anti-Human CD326（PE）染

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