【摘要】：背景及目的:小細(xì)胞肺癌約占全體肺癌的20%,是惡性程度最高,預(yù)后最差的惡性腫瘤之一,五年生存率低于5%。小細(xì)胞肺癌無(wú)明確的靶向驅(qū)動(dòng)基因,易復(fù)發(fā),預(yù)后差。細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶1(Chk1)會(huì)使化療藥物作用下DNA損傷的腫瘤細(xì)胞周期停滯,并促進(jìn)DNA同源重組及損傷修復(fù),被認(rèn)為是化療耐藥的主要原因之一。Chk1抑制劑消除S期內(nèi)檢測(cè)點(diǎn)監(jiān)測(cè),可以造成復(fù)制災(zāi)難促進(jìn)細(xì)胞凋亡;抑制消除DNA毒性藥物造成細(xì)胞周期阻滯,促使細(xì)胞攜帶受損DNA進(jìn)入有絲分裂期,造成有絲分裂災(zāi)難促使細(xì)胞死亡,Chk1抑制劑在某些實(shí)體腫瘤的臨床實(shí)驗(yàn)中也表現(xiàn)出一定的對(duì)腫瘤的抑制作用,但Chk1抑制劑對(duì)小細(xì)胞肺癌的作用效果仍不清楚,作用機(jī)制仍不明確。是否與順鉑有協(xié)同作用,對(duì)順鉑耐藥的小細(xì)胞肺癌是否有逆轉(zhuǎn)效果同樣需要研究,我們希望在臨床病例分析、細(xì)胞分子水平及動(dòng)物模型三方面探討Chk1抑制劑對(duì)小細(xì)胞肺癌的抑瘤作用和促凋亡機(jī)制。同時(shí),限制Chk1抑制劑的臨床應(yīng)用主要由于藥物的毒副作用、耐受性和藥物的繼發(fā)性耐藥,我們希望通過(guò)構(gòu)建Chk1抑制劑繼發(fā)性耐藥小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系,研究繼發(fā)性耐藥中的細(xì)胞特性和耐藥水平的調(diào)控機(jī)制,篩選耐藥熱點(diǎn)蛋白和可能性致耐藥的信號(hào)通路,為小細(xì)胞肺癌的治療提供潛在的新靶點(diǎn),并深入了解耐藥調(diào)控機(jī)制為耐藥逆轉(zhuǎn)提供新的思路和策略。方法:應(yīng)用細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶1抑制劑prexasertib(LY2606368)及聯(lián)合順鉑對(duì)不同P53及Rb基因狀態(tài)的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的抑瘤效果進(jìn)行研究,應(yīng)用CellTitle Glo檢測(cè)細(xì)胞存活率,同時(shí)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、蛋白印跡法對(duì)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞內(nèi)各細(xì)胞周期影響及Caspase依賴(lài)性細(xì)胞凋亡通路的蛋白變化進(jìn)行研究,同時(shí)以siRNA調(diào)減,慢病毒轉(zhuǎn)染調(diào)高關(guān)鍵蛋白驗(yàn)證,通過(guò)siRNA調(diào)減、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染調(diào)高E2F1表達(dá),qRT-PCR及蛋白印跡驗(yàn)證E2F1在Chk1抑制劑抑瘤作用中所起作用。建立順鉑繼發(fā)耐藥細(xì)胞系,了解通過(guò)裸鼠異種腫瘤原位種植技術(shù)驗(yàn)證細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶1及其聯(lián)合順鉑時(shí)對(duì)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系及順鉑耐藥細(xì)胞系的抑瘤作用。建立Chk1抑制劑繼發(fā)性耐藥小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系,應(yīng)用反向蛋白序列分析(RPPA)對(duì)比親代系篩選熱點(diǎn)靶向蛋白,對(duì)建立的Chk1抑制劑繼發(fā)性耐藥的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系通過(guò)siRNA調(diào)減,電轉(zhuǎn)染親代系調(diào)高相應(yīng)RPPA篩選的熱點(diǎn)蛋白,應(yīng)用CellTitleGlo,蛋白印跡,qRT-PCR觀察對(duì)Chk1抑制劑耐藥能力的變化及相關(guān)凋亡蛋白和細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的變化情況,對(duì)繼發(fā)性耐藥細(xì)胞系進(jìn)行單細(xì)胞克隆培養(yǎng),應(yīng)用用CellTitleGlo,蛋白印跡,qRT-PCR應(yīng)用對(duì)單克隆觀察Wee1基因拷貝數(shù)變化,mRNA水平,蛋白水平表達(dá)與耐藥水平的相關(guān)性。通過(guò)免疫組化,組織芯片對(duì)手術(shù)切除小細(xì)胞肺癌Wee1、Chk1表達(dá)水平及與預(yù)后相關(guān)性分析。結(jié)果:Chk1抑制劑可以在不同p53基因狀態(tài)的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中觀察到明顯的抑瘤效果,同時(shí)和順鉑有明顯的協(xié)同效應(yīng)。Chk1抑制劑可以消除順鉑處理后造成的G1/S及G2/M期細(xì)胞周期阻滯,細(xì)胞凋亡明顯增加,DNA損傷標(biāo)志物γH2AX,DNA損傷修復(fù)標(biāo)志物Cleaved PARP明顯增加,細(xì)胞周期進(jìn)入有絲分裂期的標(biāo)志物pHH3均明顯增高。Western Blot顯示單獨(dú)應(yīng)用Chk1抑制劑或siChk1處理或聯(lián)合應(yīng)用順鉑后對(duì)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的協(xié)同抑瘤作用,這種抑瘤作用主要通過(guò)激活Caspase為主導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路并下調(diào)E2F1表達(dá)形成的。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Chk1抑制劑對(duì)小細(xì)胞肺癌有抑瘤作用,同順鉑有協(xié)同作用,并能逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥,Wee1的表達(dá)水平與Chk1繼發(fā)性耐藥水平顯著相關(guān),siRNA調(diào)減Wee1或應(yīng)用Wee1抑制劑可以逆轉(zhuǎn)耐藥,消除G2/M期阻滯,增加細(xì)胞凋亡。親代系質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后可以獲得耐藥能力,同時(shí)對(duì)Wee1調(diào)控的下游蛋白和激酶CDK1及CDC25C應(yīng)用相應(yīng)的siRNA調(diào)減后均會(huì)使親代系獲得耐藥能力。單細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)提示W(wǎng)ee1 DNA拷貝數(shù)、mRNA相對(duì)水平及蛋白表達(dá)水平與繼發(fā)耐藥水平呈顯著正相關(guān)。RPPA篩選出耐藥系中表達(dá)調(diào)高的蛋白主要集中在細(xì)胞凋亡和增殖,細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白上,其中p38MAPK在應(yīng)用藥物處理后其磷酸化蛋白增高7倍以上,siRNA或小分子抑制劑調(diào)低p38MAPK表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)Chk1抑制劑繼發(fā)性耐藥小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的耐藥性。TMA結(jié)果提示小細(xì)胞患者中Chk1與E2F1及Wee1表達(dá)呈正相關(guān),Wee1表達(dá)與小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后呈正相關(guān),Chk1表達(dá)與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論:Chk1抑制劑在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出對(duì)小細(xì)胞肺癌特別是p53突變的小細(xì)胞肺癌明確的抑瘤作用,Chk1抑制劑與順鉑等化療毒性藥物有協(xié)同抑瘤作用。Chk1抑制劑可以逆轉(zhuǎn)小細(xì)胞肺癌的繼發(fā)性耐藥。Ch1抑制劑主要通過(guò)Caspase通路和下調(diào)E2F1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。Wee1過(guò)表達(dá)在Chk1抑制劑繼發(fā)耐藥中起重要作用,Wee1DNA拷貝數(shù)、mRNA水平及蛋白水平與繼發(fā)耐藥能力顯著相關(guān)。p38MAPK信號(hào)通路旁路激活也可能在Chk1抑制劑繼發(fā)性耐藥的形成機(jī)制中起到一定的作用。Chk1和Wee1可以成為小細(xì)胞肺癌預(yù)后生存的預(yù)測(cè)因子之一。Chk1抑制劑與Wee1抑制劑聯(lián)合應(yīng)用有可能為小細(xì)胞肺癌的治療提供新的治療靶點(diǎn)和治療策略。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R734.2
【圖文】：

28圖 1. 抑制 Chk1 可以增強(qiáng)小細(xì)胞肺癌中順鉑介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞毒性作用并活化 Caspase-2/3(A-B) 細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)：人類(lèi)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系在不同試劑處理 72 小時(shí)后的腫瘤細(xì)胞存活率(A) 1 M 順鉑, 300nM AZD7762, 及兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用(B) 1 M 順鉑, 30nM Chk1 抑制劑

天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文 一 Chk1 抑制劑對(duì)小細(xì)胞肺癌的抑瘤作用prexasertib 及兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用(C) 細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)：檢測(cè)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系 GLC4 轉(zhuǎn)染下列 siRNA：空白 siRNA(siControl), Chk1 (siCHK1), 和/或 Chk2 (siCHK2), 聯(lián)合或不聯(lián)合順鉑 (2.5 M) 處理 72 小時(shí)后 (D) 細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)：在順鉑存在的情況下，檢測(cè) p53 基因突變型或 p53 基因野生型小細(xì)胞肺癌細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染 siControl 或 siCHK1 的細(xì)胞存活率； 蛋白質(zhì)印跡法 檢測(cè)(E) Chk1, Chk2, cleaved caspase 3 活化片段, (F) GLC4 小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系聯(lián)合或不聯(lián)合順鉑，同時(shí)應(yīng)用 siRNA 轉(zhuǎn)染后的凋亡相關(guān)蛋白的水平。以 -tubulin 作為內(nèi)參蛋白。 非配對(duì)雙截尾 t 檢驗(yàn) p 值: *p<0.05; **p<0.005; ns:無(wú)顯著性差別。

天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文 一 Chk1 抑制劑對(duì)小細(xì)胞肺癌的抑瘤作用小時(shí)給藥，隨后第 24th小時(shí)加入順鉑; cisplatin followed by AZD: 順鉑在第 0th小時(shí)給藥，隨后 AZD7762 在第 24th小時(shí)加入. (B) 柱狀圖顯示在下列相應(yīng)處理 96 小時(shí)后細(xì)胞存活率的變化情況（倍數(shù)變化），相同實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次，所有數(shù)據(jù)表示為中位數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)差。

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本文編號(hào)：2776736