【摘要】：目的:據(jù)統(tǒng)計表明,乳腺癌是目前全球女性最常見的惡性腫瘤,每年約有138萬新發(fā)患者,迄今為止已造成4600萬患者死亡~([1])。在過去的三十年內(nèi)我國乳腺癌的發(fā)病率不斷上升,目前已成為女性惡性腫瘤的首位~([2,3])。雌激素受體(Estrogen receptor,ER)表達的乳腺癌在歐美占60~70%,在我國大約50%。術(shù)后應(yīng)用5年雌激素受體拮抗劑他莫昔芬(Tamoxifen,TAM)每年可降低乳腺癌復(fù)發(fā)率及死亡率分別為47%及26%~([4,5])。他莫昔芬在絕經(jīng)前后乳腺癌患者中廣泛應(yīng)用,對于乳腺癌患者的治療非常重要。然而,約三分之一的ER陽性乳腺癌內(nèi)分泌治療原發(fā)性耐藥,幾乎全部患者在內(nèi)分泌治療一段時間后獲得性耐藥。他莫昔芬耐藥嚴(yán)重影響乳腺癌患者的生存和預(yù)后,然而其耐藥機制十分復(fù)雜,至今尚無突破性進展。因此,深入研究乳腺癌他莫昔芬耐藥的機制,具有重大意義。目前,乳腺癌內(nèi)分泌耐藥機制研究的熱點主要集中在生長因子及其受體(如人表皮生長因子受體2,即HER-2),與雌激素受體信號通路之間的調(diào)節(jié)方面~([6-9])。在一般情況下,乳腺癌細胞的雌激素受體(ER)主要在細胞核內(nèi)發(fā)揮作用,而只有少量處于細胞膜上或者細胞質(zhì)中~([10]),雌激素與雌激素受體結(jié)合后進入細胞核內(nèi),通過配體依賴性方式促使細胞增殖~([11])。人表皮生長因子受體2(HER-2)異常高表達時,可以造成雌激素受體由細胞核內(nèi)遷移到細胞膜上~([12])。HER-2與ER相互作用(Cross-talk),通過ER膜受體信號通路活化下游的PI3K和MAPK信號分子,促使核內(nèi)雌激素依賴性及非依賴性功能轉(zhuǎn)錄區(qū)均發(fā)生活化,并使他莫昔芬由雌激素受體拮抗劑轉(zhuǎn)變?yōu)榕d奮劑,進而發(fā)生他莫昔芬耐藥~([13-15])。由此可見,ER膜受體信號通路活化是他莫昔芬耐藥的重要機制,HER-2與ER在細胞膜上的Cross-talk是耐藥發(fā)生的必要條件。然而迄今為止,HER-2與ER是如何相互作用的,在什么場所相互作用,又受哪些因素調(diào)控并不清楚。脂筏是在細胞膜上不連續(xù)分布的、具有特殊功能的微區(qū)域。脂筏通過動態(tài)聚集、募集及靶向運輸作用為蛋白分子相互作用提供功能平臺。既往研究證明ER膜受體信號通路的活化需要在脂筏內(nèi)完成,ER轉(zhuǎn)位于細胞膜后與脂筏相連~([13])。抑制脂筏聚集,則ER膜受體信號通路活性被抑制~([16])。在轉(zhuǎn)染HER2的MCF-7/HER2細胞,HER-2與ER在脂筏內(nèi)聚集形成受體復(fù)合物~([17])。因此,我們推測ER-c-Src-HER-2復(fù)合物形成是HER-2介導(dǎo)他莫昔芬耐藥的前提,而脂筏是ER-c-Src-HER-2三聚復(fù)合物形成和活化的重要場所。另外,研究表明Cbl家族泛素連接酶能夠抑制脂筏功能。Cbl家族主要有兩個成員,分別為c-Cbl和Cbl-b,這兩個泛素連接酶的作用機制主要為通過特定結(jié)構(gòu)識別目標(biāo)蛋白,促使其發(fā)生泛素化及降解來調(diào)節(jié)靶蛋白功能~([18])。泛素連接酶c-Cbl和Cbl-b是脂筏的重要調(diào)節(jié)蛋白。國外研究顯示,Cbl-b通過抑制脂筏聚集抑制T細胞受體等的聚集~([19])。我們既往的研究顯示,Cbl-b能夠清除脂筏內(nèi)效應(yīng)因子;我們最近的研究顯示,奧沙利鉑可以使c-Cbl以及Cbl-b的表達下降,進而促進胃癌細胞內(nèi)的脂筏聚集,而c-Cbl和Cbl-b的過表達能夠抑制胃癌細胞脂筏聚集~([20-24])。因此,我們推測c-Cbl可能通過抑制脂筏聚集,抑制ER-c-Src-HER-2三聚復(fù)合物的形成進而抑制ER與HER-2之間的串話,逆轉(zhuǎn)他莫昔芬耐藥,提高他莫昔芬治療的敏感性。本課題的研究目的旨在通過一系列體外、體內(nèi)實驗探討HER-2過表達乳腺癌細胞他莫昔芬耐藥的機制,探討脂筏在他莫昔芬耐藥過程中所發(fā)揮的作用,探討c-Cbl對HER-2過表達乳腺癌他莫昔芬耐藥的調(diào)控,為臨床逆轉(zhuǎn)他莫昔芬耐藥尋找潛在的作用靶點。材料與方法1、實驗選用HER-2過表達乳腺癌細胞系BT474及HER-2低表達乳腺癌細胞系T47D,利用光學(xué)顯微鏡觀察細胞形態(tài)。2、采用Western Blot方法檢測HER-2,c-Src,ER,PR,c-Cbl,Caveolin-1,Actin等蛋白的表達。3、應(yīng)用MTT及集落形成方法檢測乳腺癌細胞的增殖活性及其對他莫昔芬的藥物敏感性。4、采用免疫沉降方法檢測蛋白質(zhì)之間的相互結(jié)合。5、采用免疫熒光技術(shù)觀察乳腺癌細胞表面脂筏的分布情況。6、利用Lipofectamine 2000向BT474細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染HER-2的si-RNA。7、應(yīng)用酶切法構(gòu)建3×flagCMV9-c-Cbl過表達質(zhì)粒,經(jīng)測序驗證后采用Lipofectamine 2000試劑進行轉(zhuǎn)染實驗。8、應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染法構(gòu)建c-Cbl過表達的乳腺癌細胞株。9、利用裸鼠皮下移植瘤模型檢測過表達c-Cbl后皮下移植瘤對他莫昔芬的敏感性。10、利用免疫組化方法檢測裸鼠移植瘤標(biāo)本中乳腺癌細胞的蛋白表達情況。11、統(tǒng)計學(xué)分析:每個數(shù)據(jù)均為3次獨立實驗的結(jié)果,最終表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。實驗完成后應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS17.0分析,判斷實驗結(jié)果是否具有統(tǒng)計學(xué)意義。實驗結(jié)果1、HER-2過表達乳腺癌BT474細胞對他莫昔芬耐藥,而HER-2低表達T47D細胞對他莫昔芬敏感首先,利用MTT方法檢測BT474細胞與T47D細胞對于不同濃度他莫昔芬(TAM)的敏感性;進一步,我們又應(yīng)用集落形成的方法驗證了BT474與T47D對他莫昔芬的敏感性差異。結(jié)果顯示:應(yīng)用不同濃度他莫昔芬對兩種細胞作用72小時后(TAM濃度范圍為0.1~1μmol/L),T47D細胞系已經(jīng)看到了明顯的增殖抑制,而BT474則表現(xiàn)為相對耐藥;集落形成實驗與MTT實驗表現(xiàn)為同樣的趨勢,P0.05,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。2、BT474細胞中存在ER-c-Src-HER-2三聚復(fù)合物,而T47D細胞中檢測不到該三聚復(fù)合物我們應(yīng)用免疫沉降的方法在BT474細胞系中檢測到了ER-c-Src-HER-2三聚復(fù)合物的存在。為了進一步模擬體內(nèi)情況,我們在培養(yǎng)體系中引入了雌激素及他莫昔芬并再次檢測ER-c-Src-HER-2三聚復(fù)合物的形成情況。結(jié)果提示,在耐藥細胞系BT474中,不論應(yīng)用雌激素和/或他莫昔芬處理與否,均可以檢測到ER-c-Src-HER-2三聚復(fù)合物的形成;而在他莫昔芬敏感的細胞系T47D中則始終不存在這一復(fù)合物。3、BT474細胞中,ER-c-Src-HER-2復(fù)合物的關(guān)鍵分子HER-2異�；罨M一步比較應(yīng)用雌激素和/或他莫昔芬處理后,兩個細胞系中HER-2,c-Src,ER的磷酸化的情況,結(jié)果顯示,他莫昔芬耐藥的細胞系BT474與敏感細胞系T47D相比其主要特征為HER-2信號的異�；罨�,且不能受到他莫昔芬的抑制。4、抑制脂筏功能干擾ER-c-Src-HER-2三聚復(fù)合物的形成應(yīng)用制霉菌素(Nystatin,終濃度5μg/ml)預(yù)處理BT474細胞2小時之后進行免疫沉降,與未應(yīng)用制霉菌素處理的對照組進行比較,我們發(fā)現(xiàn)在應(yīng)用制霉菌素抑制脂筏功能后,ER-c-Src-HER-2三聚復(fù)合物的形成明顯減少,同時HER-2信號活化明顯減弱。5、抑制脂筏功能逆轉(zhuǎn)BT474細胞的他莫昔芬耐藥應(yīng)用制霉菌素預(yù)處理BT474細胞2小時抑制脂筏功能后,再應(yīng)用雌激素和/或他莫昔芬作用48小時后進行MTT實驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與未應(yīng)用制霉菌素處理的對照組進行相比,應(yīng)用制霉菌素抑制脂筏功能后,BT474細胞對于他莫昔芬的敏感性增強,耐藥情況得到部分逆轉(zhuǎn)。另一方面,我們采用集落形成方法,進一步驗證了抑制脂筏功能對他莫昔芬敏感性的影響。6、過表達c-Cbl通過抑制ER-c-Src-HER-2三聚復(fù)合物的形成,逆轉(zhuǎn)乳腺癌他莫昔芬耐藥應(yīng)用酶切法構(gòu)建3×Flag CMV9-c-Cbl過表達質(zhì)粒,經(jīng)測序驗證后,轉(zhuǎn)染BT474細胞進行c-Cbl蛋白的過表達。免疫沉降結(jié)果證實,過表達c-Cbl后在BT474細胞中形成的ER-c-Src-HER-2復(fù)合物減少;Western Blot檢測過表達c-Cbl后BT474細胞的信號通路的變化,結(jié)果顯示在過表達c-Cbl后BT474細胞的HER-2、ER磷酸化減弱;MTT,集落形成實驗實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達c-Cbl后部分逆轉(zhuǎn)了BT474細胞對他莫昔芬的耐藥;裸鼠皮下成瘤實驗進一步在體內(nèi)證實過表達c-Cbl可以部分逆轉(zhuǎn)他莫昔芬耐藥。結(jié)論1、HER-2過表達乳腺癌細胞對他莫昔芬耐藥,在他莫昔芬耐藥的細胞中存在ER-c-Src-HER-2三聚復(fù)合物;2、抑制脂筏功能減少HER-2過表達乳腺癌細胞中ER-c-Src-HER-2三聚復(fù)合物的形成,進而抑制HER-2、ER信號通路活化,逆轉(zhuǎn)HER-2過表達乳腺癌細胞的他莫昔芬耐藥;3、過表達c-Cbl可以通過抑制ER-c-Src-HER-2三聚復(fù)合物的形成,逆轉(zhuǎn)HER-2過表達乳腺癌細胞的他莫昔芬耐藥。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.9
【圖文】：

3.1 HER-2 過表達 BT474 細胞對他莫昔芬耐藥，而 HER-2 陰性細胞 T47對他莫昔芬敏感我們首先驗證 BT474 和 T47D 的細胞特性，結(jié)果證實 BT474 細胞雌激素受（ER）為陽性表達，人表皮生長因子受體 2（HER-2）為過表達狀態(tài)，而實驗照細胞 T47D 的 ER 表達為陽性，HER-2 表達為陰性（圖 1）。接下來，我們應(yīng)MTT 方法檢測了在 17-β 雌二醇濃度為 10 nmol/L 的條件下兩種細胞系對于不同度他莫昔芬（TAM）的敏感性；進一步，我們又應(yīng)用集落形成的方法驗證了 BT4與 T47D 對他莫昔芬的敏感性差異。結(jié)果顯示：在應(yīng)用不同濃度他莫昔芬對兩細胞進行作用，72 小時后，我們可以看到在 0.1~1 μmol/L 的他莫昔芬作用下，T47細胞系已經(jīng)看到了明顯的增殖抑制，而 BT474 則表現(xiàn)為相對耐藥（圖 2）；細胞種于 6 孔板中，24 小時后加藥作用，之后再培養(yǎng) 14 天，通過 Giemsa 染液染色察拍照，集落形成實驗集落形成實驗與 MTT 實驗表現(xiàn)為了同樣的趨勢，BT4細胞相對耐藥（如圖 3 所示），經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

不同濃度他莫昔芬作用兩種乳腺癌細胞后，細胞增殖的變化情況。BT474 細胞和 T47D 細胞中加入 10nM E2 及不同濃度的他莫昔芬處理 48 小時后的增殖變化，如圖所示，T47D 細胞較為敏感，而 BT474 細胞表現(xiàn)為耐藥（標(biāo)注*的 3 組 P<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義）。

集落形成實驗顯示 BT474 細胞對他莫昔芬耐藥A 圖為集落形成實驗結(jié)果 1 倍圖，其中 E2 為 10 nmol/L 雌激素處理組，E2+TAM 為 10 nmol/L 雌激素，1 μmol/L 他莫昔芬聯(lián)合處理組。B 圖為集落形成實驗集落計數(shù)的柱形圖；CON：對照；E：10 nmol/L 雌激素處理組；T：1 μmol/L他莫昔芬處理組；E2/TAM：聯(lián)合處理組，應(yīng)用 10 nmol/L 雌激素，1 μmol/L 他莫昔芬 (*P<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義)。3.2 HER-2 過表達的 BT474 細胞中存在 ER-c-Src-HER-2 三聚復(fù)合物HER-2 過表達的細胞系 BT474 存在著明顯的他莫昔芬耐藥，那么發(fā)生耐藥的機制是什么呢？我們應(yīng)用免疫沉降的方法在耐藥細胞系中檢測到了 ER，c-Src，HER-2 三種蛋白的共結(jié)合，說明在耐藥系中有 ER-c-Src-HER-2 三聚復(fù)合物的形成（圖 4），三聚復(fù)合物的形成可能是 BT474 細胞他莫昔芬耐藥發(fā)生的關(guān)鍵。為了深入探討三聚復(fù)合物在他莫昔芬耐藥細胞系及敏感細胞系中的形成情況，我們進一

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Protective autophagy antagonizes oxaliplatin-induced apoptosis in gastric cancer cells[J];癌癥;2011年07期

本文編號：2776734