發(fā)布時(shí)間：2020-07-31 16:42

【摘要】：目的:據(jù)統(tǒng)計(jì)表明,乳腺癌是目前全球女性最常見的惡性腫瘤,每年約有138萬新發(fā)患者,迄今為止已造成4600萬患者死亡~([1])。在過去的三十年內(nèi)我國乳腺癌的發(fā)病率不斷上升,目前已成為女性惡性腫瘤的首位~([2,3])。雌激素受體(Estrogen receptor,ER)表達(dá)的乳腺癌在歐美占60~70%,在我國大約50%。術(shù)后應(yīng)用5年雌激素受體拮抗劑他莫昔芬(Tamoxifen,TAM)每年可降低乳腺癌復(fù)發(fā)率及死亡率分別為47%及26%~([4,5])。他莫昔芬在絕經(jīng)前后乳腺癌患者中廣泛應(yīng)用,對(duì)于乳腺癌患者的治療非常重要。然而,約三分之一的ER陽性乳腺癌內(nèi)分泌治療原發(fā)性耐藥,幾乎全部患者在內(nèi)分泌治療一段時(shí)間后獲得性耐藥。他莫昔芬耐藥嚴(yán)重影響乳腺癌患者的生存和預(yù)后,然而其耐藥機(jī)制十分復(fù)雜,至今尚無突破性進(jìn)展。因此,深入研究乳腺癌他莫昔芬耐藥的機(jī)制,具有重大意義。目前,乳腺癌內(nèi)分泌耐藥機(jī)制研究的熱點(diǎn)主要集中在生長因子及其受體(如人表皮生長因子受體2,即HER-2),與雌激素受體信號(hào)通路之間的調(diào)節(jié)方面~([6-9])。在一般情況下,乳腺癌細(xì)胞的雌激素受體(ER)主要在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用,而只有少量處于細(xì)胞膜上或者細(xì)胞質(zhì)中~([10]),雌激素與雌激素受體結(jié)合后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),通過配體依賴性方式促使細(xì)胞增殖~([11])。人表皮生長因子受體2(HER-2)異常高表達(dá)時(shí),可以造成雌激素受體由細(xì)胞核內(nèi)遷移到細(xì)胞膜上~([12])。HER-2與ER相互作用(Cross-talk),通過ER膜受體信號(hào)通路活化下游的PI3K和MAPK信號(hào)分子,促使核內(nèi)雌激素依賴性及非依賴性功能轉(zhuǎn)錄區(qū)均發(fā)生活化,并使他莫昔芬由雌激素受體拮抗劑轉(zhuǎn)變?yōu)榕d奮劑,進(jìn)而發(fā)生他莫昔芬耐藥~([13-15])。由此可見,ER膜受體信號(hào)通路活化是他莫昔芬耐藥的重要機(jī)制,HER-2與ER在細(xì)胞膜上的Cross-talk是耐藥發(fā)生的必要條件。然而迄今為止,HER-2與ER是如何相互作用的,在什么場所相互作用,又受哪些因素調(diào)控并不清楚。脂筏是在細(xì)胞膜上不連續(xù)分布的、具有特殊功能的微區(qū)域。脂筏通過動(dòng)態(tài)聚集、募集及靶向運(yùn)輸作用為蛋白分子相互作用提供功能平臺(tái)。既往研究證明ER膜受體信號(hào)通路的活化需要在脂筏內(nèi)完成,ER轉(zhuǎn)位于細(xì)胞膜后與脂筏相連~([13])。抑制脂筏聚集,則ER膜受體信號(hào)通路活性被抑制~([16])。在轉(zhuǎn)染HER2的MCF-7/HER2細(xì)胞,HER-2與ER在脂筏內(nèi)聚集形成受體復(fù)合物~([17])。因此,我們推測ER-c-Src-HER-2復(fù)合物形成是HER-2介導(dǎo)他莫昔芬耐藥的前提,而脂筏是ER-c-Src-HER-2三聚復(fù)合物形成和活化的重要場所。另外,研究表明Cbl家族泛素連接酶能夠抑制脂筏功能。Cbl家族主要有兩個(gè)成員,分別為c-Cbl和Cbl-b,這兩個(gè)泛素連接酶的作用機(jī)制主要為通過特定結(jié)構(gòu)識(shí)別目標(biāo)蛋白,促使其發(fā)生泛素化及降解來調(diào)節(jié)靶蛋白功能~([18])。泛素連接酶c-Cbl和Cbl-b是脂筏的重要調(diào)節(jié)蛋白。國外研究顯示,Cbl-b通過抑制脂筏聚集抑制T細(xì)胞受體等的聚集~([19])。我們既往的研究顯示,Cbl-b能夠清除脂筏內(nèi)效應(yīng)因子;我們最近的研究顯示,奧沙利鉑可以使c-Cbl以及Cbl-b的表達(dá)下降,進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞內(nèi)的脂筏聚集,而c-Cbl和Cbl-b的過表達(dá)能夠抑制胃癌細(xì)胞脂筏聚集~([20-24])。因此,我們推測c-Cbl可能通過抑制脂筏聚集,抑制ER-c-Src-HER-2三聚復(fù)合物的形成進(jìn)而抑制ER與HER-2之間的串話,逆轉(zhuǎn)他莫昔芬耐藥,提高他莫昔芬治療的敏感性。本課題的研究目的旨在通過一系列體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討HER-2過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞他莫昔芬耐藥的機(jī)制,探討脂筏在他莫昔芬耐藥過程中所發(fā)揮的作用,探討c-Cbl對(duì)HER-2過表達(dá)乳腺癌他莫昔芬耐藥的調(diào)控,為臨床逆轉(zhuǎn)他莫昔芬耐藥尋找潛在的作用靶點(diǎn)。材料與方法1、實(shí)驗(yàn)選用HER-2過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞系BT474及HER-2低表達(dá)乳腺癌細(xì)胞系T47D,利用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。2、采用Western Blot方法檢測HER-2,c-Src,ER,PR,c-Cbl,Caveolin-1,Actin等蛋白的表達(dá)。3、應(yīng)用MTT及集落形成方法檢測乳腺癌細(xì)胞的增殖活性及其對(duì)他莫昔芬的藥物敏感性。4、采用免疫沉降方法檢測蛋白質(zhì)之間的相互結(jié)合。5、采用免疫熒光技術(shù)觀察乳腺癌細(xì)胞表面脂筏的分布情況。6、利用Lipofectamine 2000向BT474細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染HER-2的si-RNA。7、應(yīng)用酶切法構(gòu)建3×flagCMV9-c-Cbl過表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)測序驗(yàn)證后采用Lipofectamine 2000試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。8、應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染法構(gòu)建c-Cbl過表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞株。9、利用裸鼠皮下移植瘤模型檢測過表達(dá)c-Cbl后皮下移植瘤對(duì)他莫昔芬的敏感性。10、利用免疫組化方法檢測裸鼠移植瘤標(biāo)本中乳腺癌細(xì)胞的蛋白表達(dá)情況。11、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:每個(gè)數(shù)據(jù)均為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,最終表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS17.0分析,判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、HER-2過表達(dá)乳腺癌BT474細(xì)胞對(duì)他莫昔芬耐藥,而HER-2低表達(dá)T47D細(xì)胞對(duì)他莫昔芬敏感首先,利用MTT方法檢測BT474細(xì)胞與T47D細(xì)胞對(duì)于不同濃度他莫昔芬(TAM)的敏感性;進(jìn)一步,我們又應(yīng)用集落形成的方法驗(yàn)證了BT474與T47D對(duì)他莫昔芬的敏感性差異。結(jié)果顯示:應(yīng)用不同濃度他莫昔芬對(duì)兩種細(xì)胞作用72小時(shí)后(TAM濃度范圍為0.1~1μmol/L),T47D細(xì)胞系已經(jīng)看到了明顯的增殖抑制,而BT474則表現(xiàn)為相對(duì)耐藥;集落形成實(shí)驗(yàn)與MTT實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)為同樣的趨勢,P0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2、BT474細(xì)胞中存在ER-c-Src-HER-2三聚復(fù)合物,而T47D細(xì)胞中檢測不到該三聚復(fù)合物我們應(yīng)用免疫沉降的方法在BT474細(xì)胞系中檢測到了ER-c-Src-HER-2三聚復(fù)合物的存在。為了進(jìn)一步模擬體內(nèi)情況,我們?cè)谂囵B(yǎng)體系中引入了雌激素及他莫昔芬并再次檢測ER-c-Src-HER-2三聚復(fù)合物的形成情況。結(jié)果提示,在耐藥細(xì)胞系BT474中,不論應(yīng)用雌激素和/或他莫昔芬處理與否,均可以檢測到ER-c-Src-HER-2三聚復(fù)合物的形成;而在他莫昔芬敏感的細(xì)胞系T47D中則始終不存在這一復(fù)合物。3、BT474細(xì)胞中,ER-c-Src-HER-2復(fù)合物的關(guān)鍵分子HER-2異�；罨M(jìn)一步比較應(yīng)用雌激素和/或他莫昔芬處理后,兩個(gè)細(xì)胞系中HER-2,c-Src,ER的磷酸化的情況,結(jié)果顯示,他莫昔芬耐藥的細(xì)胞系BT474與敏感細(xì)胞系T47D相比其主要特征為HER-2信號(hào)的異�；罨�,且不能受到他莫昔芬的抑制。4、抑制脂筏功能干擾ER-c-Src-HER-2三聚復(fù)合物的形成應(yīng)用制霉菌素(Nystatin,終濃度5μg/ml)預(yù)處理BT474細(xì)胞2小時(shí)之后進(jìn)行免疫沉降,與未應(yīng)用制霉菌素處理的對(duì)照組進(jìn)行比較,我們發(fā)現(xiàn)在應(yīng)用制霉菌素抑制脂筏功能后,ER-c-Src-HER-2三聚復(fù)合物的形成明顯減少,同時(shí)HER-2信號(hào)活化明顯減弱。5、抑制脂筏功能逆轉(zhuǎn)BT474細(xì)胞的他莫昔芬耐藥應(yīng)用制霉菌素預(yù)處理BT474細(xì)胞2小時(shí)抑制脂筏功能后,再應(yīng)用雌激素和/或他莫昔芬作用48小時(shí)后進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)與未應(yīng)用制霉菌素處理的對(duì)照組進(jìn)行相比,應(yīng)用制霉菌素抑制脂筏功能后,BT474細(xì)胞對(duì)于他莫昔芬的敏感性增強(qiáng),耐藥情況得到部分逆轉(zhuǎn)。另一方面,我們采用集落形成方法,進(jìn)一步驗(yàn)證了抑制脂筏功能對(duì)他莫昔芬敏感性的影響。6、過表達(dá)c-Cbl通過抑制ER-c-Src-HER-2三聚復(fù)合物的形成,逆轉(zhuǎn)乳腺癌他莫昔芬耐藥應(yīng)用酶切法構(gòu)建3×Flag CMV9-c-Cbl過表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)測序驗(yàn)證后,轉(zhuǎn)染BT474細(xì)胞進(jìn)行c-Cbl蛋白的過表達(dá)。免疫沉降結(jié)果證實(shí),過表達(dá)c-Cbl后在BT474細(xì)胞中形成的ER-c-Src-HER-2復(fù)合物減少;Western Blot檢測過表達(dá)c-Cbl后BT474細(xì)胞的信號(hào)通路的變化,結(jié)果顯示在過表達(dá)c-Cbl后BT474細(xì)胞的HER-2、ER磷酸化減弱;MTT,集落形成實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)c-Cbl后部分逆轉(zhuǎn)了BT474細(xì)胞對(duì)他莫昔芬的耐藥;裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步在體內(nèi)證實(shí)過表達(dá)c-Cbl可以部分逆轉(zhuǎn)他莫昔芬耐藥。結(jié)論1、HER-2過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞對(duì)他莫昔芬耐藥,在他莫昔芬耐藥的細(xì)胞中存在ER-c-Src-HER-2三聚復(fù)合物;2、抑制脂筏功能減少HER-2過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞中ER-c-Src-HER-2三聚復(fù)合物的形成,進(jìn)而抑制HER-2、ER信號(hào)通路活化,逆轉(zhuǎn)HER-2過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞的他莫昔芬耐藥;3、過表達(dá)c-Cbl可以通過抑制ER-c-Src-HER-2三聚復(fù)合物的形成,逆轉(zhuǎn)HER-2過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞的他莫昔芬耐藥。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.9
【圖文】：

3.1 HER-2 過表達(dá) BT474 細(xì)胞對(duì)他莫昔芬耐藥，而 HER-2 陰性細(xì)胞 T47對(duì)他莫昔芬敏感我們首先驗(yàn)證 BT474 和 T47D 的細(xì)胞特性，結(jié)果證實(shí) BT474 細(xì)胞雌激素受（ER）為陽性表達(dá)，人表皮生長因子受體 2（HER-2）為過表達(dá)狀態(tài)，而實(shí)驗(yàn)照細(xì)胞 T47D 的 ER 表達(dá)為陽性，HER-2 表達(dá)為陰性（圖 1）。接下來，我們應(yīng)MTT 方法檢測了在 17-β 雌二醇濃度為 10 nmol/L 的條件下兩種細(xì)胞系對(duì)于不同度他莫昔芬（TAM）的敏感性；進(jìn)一步，我們又應(yīng)用集落形成的方法驗(yàn)證了 BT4與 T47D 對(duì)他莫昔芬的敏感性差異。結(jié)果顯示：在應(yīng)用不同濃度他莫昔芬對(duì)兩細(xì)胞進(jìn)行作用，72 小時(shí)后，我們可以看到在 0.1~1 μmol/L 的他莫昔芬作用下，T47細(xì)胞系已經(jīng)看到了明顯的增殖抑制，而 BT474 則表現(xiàn)為相對(duì)耐藥（圖 2）；細(xì)胞種于 6 孔板中，24 小時(shí)后加藥作用，之后再培養(yǎng) 14 天，通過 Giemsa 染液染色察拍照，集落形成實(shí)驗(yàn)集落形成實(shí)驗(yàn)與 MTT 實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)為了同樣的趨勢，BT4細(xì)胞相對(duì)耐藥（如圖 3 所示），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

不同濃度他莫昔芬作用兩種乳腺癌細(xì)胞后，細(xì)胞增殖的變化情況。BT474 細(xì)胞和 T47D 細(xì)胞中加入 10nM E2 及不同濃度的他莫昔芬處理 48 小時(shí)后的增殖變化，如圖所示，T47D 細(xì)胞較為敏感，而 BT474 細(xì)胞表現(xiàn)為耐藥（標(biāo)注*的 3 組 P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。

集落形成實(shí)驗(yàn)顯示 BT474 細(xì)胞對(duì)他莫昔芬耐藥A 圖為集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1 倍圖，其中 E2 為 10 nmol/L 雌激素處理組，E2+TAM 為 10 nmol/L 雌激素，1 μmol/L 他莫昔芬聯(lián)合處理組。B 圖為集落形成實(shí)驗(yàn)集落計(jì)數(shù)的柱形圖；CON：對(duì)照；E：10 nmol/L 雌激素處理組；T：1 μmol/L他莫昔芬處理組；E2/TAM：聯(lián)合處理組，應(yīng)用 10 nmol/L 雌激素，1 μmol/L 他莫昔芬 (*P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。3.2 HER-2 過表達(dá)的 BT474 細(xì)胞中存在 ER-c-Src-HER-2 三聚復(fù)合物HER-2 過表達(dá)的細(xì)胞系 BT474 存在著明顯的他莫昔芬耐藥，那么發(fā)生耐藥的機(jī)制是什么呢？我們應(yīng)用免疫沉降的方法在耐藥細(xì)胞系中檢測到了 ER，c-Src，HER-2 三種蛋白的共結(jié)合，說明在耐藥系中有 ER-c-Src-HER-2 三聚復(fù)合物的形成（圖 4），三聚復(fù)合物的形成可能是 BT474 細(xì)胞他莫昔芬耐藥發(fā)生的關(guān)鍵。為了深入探討三聚復(fù)合物在他莫昔芬耐藥細(xì)胞系及敏感細(xì)胞系中的形成情況，我們進(jìn)一

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Protective autophagy antagonizes oxaliplatin-induced apoptosis in gastric cancer cells[J];癌癥;2011年07期

本文編號(hào)：2776734