發(fā)布時(shí)間：2020-07-30 08:24

【摘要】：胃癌是一種嚴(yán)重威脅人類健康的惡性疾病,在中國(guó)有著較高的發(fā)病率。最新的研究統(tǒng)計(jì)顯示,胃癌在中國(guó)的發(fā)生率和死亡率在各類腫瘤中均排名第2位。導(dǎo)致胃癌治療效果和預(yù)后不佳的原因主要是早期診斷的匱乏,患者出現(xiàn)明顯癥狀時(shí),大多已經(jīng)處于進(jìn)展期,甚至已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的胃癌病人預(yù)后很差,其5年生存率僅為5%。然而,胃癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的過(guò)程中涉及的分子調(diào)控機(jī)理尚不清楚。因此,積極探索胃癌早期診斷方法和深入研究胃癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子機(jī)制對(duì)于治療胃癌具有重要的臨床意義。轉(zhuǎn)錄因子在幾乎所有的生物學(xué)過(guò)程中起著主導(dǎo)作用,包括細(xì)胞增殖、分裂、遷移和凋亡等。研究表明,轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)的異常調(diào)控在許多癌癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中占據(jù)核心位置。Kruppel樣因子(Kruppel-likefactor,KLF)是一類羧基端具有3個(gè)高度保守的C2H2類型鋅指結(jié)構(gòu)的核轉(zhuǎn)錄因子家族,該家族包括17個(gè)成員,他們廣泛表達(dá)于各種組織,調(diào)控著多種生物學(xué)過(guò)程。許多研究表明KLF的異常調(diào)節(jié)與多種疾病相關(guān),包括心血管疾病、代謝異常和癌癥等。在最初研究中,KLF9因其能夠特異地結(jié)合基本轉(zhuǎn)錄元件(Basic transcription element,BTE),所以被稱作基本轉(zhuǎn)錄元件結(jié)合蛋白(Basic transcription element binding protein,BTEB)。敲除KLF9基因的小鼠能夠正常生長(zhǎng)和繁殖,且與野生型小鼠在外形上無(wú)明顯差異。但是,KLF9基因敲除的雌性小鼠的生殖系統(tǒng)在結(jié)構(gòu)和功能上均有異常,表現(xiàn)為胚胎著床數(shù)目和產(chǎn)仔數(shù)目下降,以及新生幼鼠死亡率增加。最近的一系列研究表明KLF9在人類結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、前列腺癌和肝癌中扮演著抑癌因子的角色。然而,目前關(guān)于KLF9是否參與胃癌的發(fā)生發(fā)展或轉(zhuǎn)移等過(guò)程還了解甚少。為了深入研究胃癌轉(zhuǎn)移過(guò)程的分子調(diào)控機(jī)制,我們以癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ),通過(guò)單樣本基因集富集分析(single-sample gene set enrichment analysis,ssGSEA)將TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的胃癌病人分成高轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)和低轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)兩個(gè)類群,然后對(duì)這兩個(gè)類群進(jìn)行差異基因分析,從而確定了 1770個(gè)潛在的胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因。研究顯示,轉(zhuǎn)錄因子在癌癥轉(zhuǎn)移過(guò)程中具有核心調(diào)控作用,所以我們主要針對(duì)具有差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行進(jìn)一步的篩選研究。經(jīng)過(guò)在其他四個(gè)胃癌芯片數(shù)據(jù)中的進(jìn)一步驗(yàn)證,最終確認(rèn)了 5個(gè)潛在的胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子,KLF9就是其中之一。我們的生物信息學(xué)分析提示KLF9可能在胃癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要作用。為了進(jìn)一步了解KLF9在胃癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用,我們分析了在發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移病人的胃癌組織樣本中KLF9的表達(dá)情況,結(jié)果顯示KLF9在已發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移病人的胃癌組織樣本中表達(dá)量顯著低于與其年齡、性別及病理信息均配對(duì)的未發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移病人,提示KLF9可能扮演了胃癌轉(zhuǎn)移抑制因子的角色。進(jìn)一步的基因集富集分析(Gene set enrichment analysis,GSEA)也提示了與癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)的多個(gè)基因集均明顯富集于KLF9相對(duì)低表達(dá)的胃癌病人群體。為了探究KLF9對(duì)胃癌細(xì)胞的具體影響,我們?cè)诙鄠�(gè)胃癌細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)KLF9或利用RNA干擾下調(diào)KLF9表達(dá)水平,觀察其細(xì)胞生物學(xué)表型。結(jié)果表明,下調(diào)KLF9對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖及克隆形成能力沒(méi)有顯著影響,但是能夠顯著提升其遷移和侵襲能力。相反,過(guò)表達(dá)KLF9會(huì)顯著抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。這些結(jié)果提示,KLF9能夠抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力,但是不影響其增殖和克隆形成能力。進(jìn)一步,我們通過(guò)尾靜脈注射的方法探究KLF9對(duì)胃癌細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的肺轉(zhuǎn)移能力的影響。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,穩(wěn)定過(guò)表達(dá)KLF9的胃癌細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的肺轉(zhuǎn)移能力顯著下降,進(jìn)一步表明了 KLF9是胃癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中的抑制因子。由于KLF9在胃癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮抑制因子的功能,我們希望進(jìn)一步探究KLF9調(diào)控胃癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。轉(zhuǎn)錄因子是一類能夠結(jié)合目的基因5'上游特定序列從而保證其在特定時(shí)間和空間表達(dá)的蛋白分子。為了確定KLF9調(diào)控的靶基因,我們分析了現(xiàn)有的KLF9染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序(Chromatin immunoprecipitation sequencing,ChIP-seq)數(shù)據(jù)。通過(guò)系統(tǒng)的分析,我們確定了 823個(gè)潛在的KLF9靶基因。接下來(lái),我們從這些潛在的靶基因中篩選出已有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)與癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因作為主要研究對(duì)象,探究其在過(guò)表達(dá)KLF9的胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況。檢測(cè)結(jié)果顯示,金屬機(jī)制蛋白酶家族成員28(Matrix metalloproteinase 28,MMP28)的mRNA和蛋白水平在KLF9過(guò)表達(dá)的胃癌細(xì)胞中明顯下降。進(jìn)一步的雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了 KLF9在MMP28啟動(dòng)子區(qū)域有著特異性結(jié)合。以上結(jié)果提示,在胃癌細(xì)胞中,KLF9能夠特定地抑制MMP28的mRNA表達(dá),進(jìn)而降低MMP28的蛋白水平。為了進(jìn)一步確認(rèn)KLF9通過(guò)介導(dǎo)MMP28的轉(zhuǎn)錄沉默來(lái)抑制胃癌的轉(zhuǎn)移,我們進(jìn)行了挽救實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,在KLF9過(guò)表達(dá)的胃癌細(xì)胞中進(jìn)一步過(guò)表達(dá)MMP28使其蛋白水平恢復(fù)至對(duì)照組水平,能夠部分挽救由KLF9過(guò)表達(dá)所導(dǎo)致的胃癌細(xì)胞侵襲能力下降的表型。通過(guò)進(jìn)一步的小鼠尾靜脈檢測(cè)胃癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移能力的實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)挽救組的肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)目恢復(fù)到與對(duì)照組相當(dāng)?shù)乃?顯著高于KLF9過(guò)表達(dá)組。以上結(jié)果提示,過(guò)表達(dá)MMP28能夠有效地挽救由過(guò)表達(dá)KLF9導(dǎo)致的胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力降低的表型。綜上所述,本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析、細(xì)胞生物學(xué)驗(yàn)證以及動(dòng)物模型體內(nèi)驗(yàn)證等多種實(shí)驗(yàn)手段,發(fā)現(xiàn)了一個(gè)全新的抑制胃癌轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)錄因子——KLF9。通過(guò)進(jìn)一步的分析和驗(yàn)證,我們證實(shí)了 KLF9通過(guò)介導(dǎo)MMP28的轉(zhuǎn)錄沉默來(lái)抑制胃癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。本研究對(duì)于闡明胃癌轉(zhuǎn)移過(guò)程的分子機(jī)制有一定意義,并為治療胃癌轉(zhuǎn)移提供了新的思路和藥物靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.2
【圖文】：

邐實(shí)驗(yàn)結(jié)果逡逑圖３．１．２篩選與胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。（Ａ）篩選流程圖。首先通過(guò)比較Ｃ１和Ｃ２兩逡逑組胃癌病人的差異表達(dá)基因分析，得到１７７０個(gè)差異基因，篩選標(biāo)準(zhǔn)為ｌｏｇ２（Ｃｌ／Ｃ２）＞ｌ或＜－１，逡逑Ｐ＜０．０５。（Ｂ）韋恩圖顯示，Ｃ１與Ｃ２組比較后得出下調(diào)的１４０８差異基因與ＦＡＮＴＯＭ５轉(zhuǎn)錄逡逑因子數(shù)據(jù)庫(kù)取共同基因，再與ＴＣＧＡ胃癌樣本中癌組織與癌旁組織的差異基因取交集，進(jìn)一逡逑步通過(guò)與ＧＳＥ１９８２６，邋ＧＳＥ２９２７２，邋ＧＳＥ１３９丨１，ＧＳＥ１３８６１這四個(gè)胃癌芯片中的差異表達(dá)基因逡逑取交集，最終篩選出與胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的５個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。值得注意的是，３６２個(gè)ＣＩ相對(duì)于Ｃ２逡逑上調(diào)的基因中并未篩選出有代表性的胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子。篩選差異基因的標(biāo)準(zhǔn)為逡逑ｌｏｇ２（Ｔｕｍｏｒ／Ｎｏｒｍａｌ）＞ｌ或＜－１，尸＜０．０５。（Ｃ）列表所示為５個(gè)胃癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，包含其基逡逑因名、全稱、在ＴＣＧＡ數(shù)據(jù)庫(kù)中的癌組織比癌旁組織差異變化倍數(shù)和直等信息。逡逑３．２邋ＫＬＦ９在發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移胃癌病人中表達(dá)量下降逡逑３．２．１邋ＫＬＦ９在胃癌組織中的表達(dá)董相較于癌旁組織顯著下降逡逑為了確定ＫＬＦ９在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的表達(dá)情況，我們分析了邋ＴＣＧＡ中胃逡逑癌測(cè)序數(shù)據(jù)和ＧＳＥ１９８２６、ＧＳＥ２９２７２、ＧＳＥ１３９１１、ＧＳＥ１３８６１這４個(gè)胃癌芯片數(shù)逡逑據(jù)中ＫＬＦ９基因的表徸情況。結(jié)果顯示

邐實(shí)驗(yàn)結(jié)果逡逑圖３．１．２篩選與胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。（Ａ）篩選流程圖。首先通過(guò)比較Ｃ１和Ｃ２兩逡逑組胃癌病人的差異表達(dá)基因分析，得到１７７０個(gè)差異基因，篩選標(biāo)準(zhǔn)為ｌｏｇ２（Ｃｌ／Ｃ２）＞ｌ或＜－１，逡逑Ｐ＜０．０５。（Ｂ）韋恩圖顯示，Ｃ１與Ｃ２組比較后得出下調(diào)的１４０８差異基因與ＦＡＮＴＯＭ５轉(zhuǎn)錄逡逑因子數(shù)據(jù)庫(kù)取共同基因，再與ＴＣＧＡ胃癌樣本中癌組織與癌旁組織的差異基因取交集，進(jìn)一逡逑步通過(guò)與ＧＳＥ１９８２６，邋ＧＳＥ２９２７２，邋ＧＳＥ１３９丨１，ＧＳＥ１３８６１這四個(gè)胃癌芯片中的差異表達(dá)基因逡逑取交集，最終篩選出與胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的５個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。值得注意的是，３６２個(gè)ＣＩ相對(duì)于Ｃ２逡逑上調(diào)的基因中并未篩選出有代表性的胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子。篩選差異基因的標(biāo)準(zhǔn)為逡逑ｌｏｇ２（Ｔｕｍｏｒ／Ｎｏｒｍａｌ）＞ｌ或＜－１，尸＜０．０５。（Ｃ）列表所示為５個(gè)胃癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，包含其基逡逑因名、全稱、在ＴＣＧＡ數(shù)據(jù)庫(kù)中的癌組織比癌旁組織差異變化倍數(shù)和直等信息。逡逑３．２邋ＫＬＦ９在發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移胃癌病人中表達(dá)量下降逡逑３．２．１邋ＫＬＦ９在胃癌組織中的表達(dá)董相較于癌旁組織顯著下降逡逑為了確定ＫＬＦ９在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的表達(dá)情況，我們分析了邋ＴＣＧＡ中胃逡逑癌測(cè)序數(shù)據(jù)和ＧＳＥ１９８２６、ＧＳＥ２９２７２、ＧＳＥ１３９１１、ＧＳＥ１３８６１這４個(gè)胃癌芯片數(shù)逡逑據(jù)中ＫＬＦ９基因的表徸情況。結(jié)果顯示

浙江大學(xué)博士學(xué)位論文邐邐邐實(shí)驗(yàn)結(jié)果逡逑３．２．３邐ＧＳＥＡ分析顯示ＫＬＦ９表達(dá)量與癌癥轉(zhuǎn)移顯著負(fù)相關(guān)逡逑為了探究ＫＬＦ９的表達(dá)情況與癌癥轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，我們針對(duì)ＴＣＧＡ數(shù)據(jù)庫(kù)中逡逑３８８例胃癌樣本進(jìn)行了基因集富集分析（Ｇｅｎｅｓｅｔｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓ，邋ＧＳＥＡ）。首逡逑先，我們將３８８例胃癌樣本按照ＫＬＦ９表達(dá)模式分為ＫＬＦ９高表達(dá)和ＫＬＦ９低表達(dá)逡逑兩組，每組各１９４例。經(jīng)過(guò)基因集富集分析，結(jié)果顯示ＫＬＦ９的表達(dá)量與多個(gè)癌癥逡逑轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因集和腫瘤侵襲能力相關(guān)基因集呈現(xiàn)明顯負(fù)相關(guān)，即ＫＬＦ９的低表達(dá)逡逑某種程度上提示腫瘤更傾向于發(fā)生轉(zhuǎn)移（圖３．２．３）。此外，ＫＬＦ９還與胃癌早期發(fā)逡逑生的基因集呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)，這也印證了邋ＫＬＦ９在胃癌發(fā)生發(fā)展中起著抑制作用。逡逑以上結(jié)果進(jìn)一步提示我們ＫＬＦ９可能扮演著癌癥轉(zhuǎn)移抑制因子的角色。逡逑ＰＲＯＶＥＮＺＡＮＩ＿ＭＥＴＡＳＴＡＳＩＳ＿ＵＰＡ

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3 王翠U

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