【摘要】：肺癌是全世界范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的主要原因,在我國肺癌的發(fā)生率和致死率居高不下,五年生存率仍然非常低。然而肺癌發(fā)生發(fā)展所涉及的復(fù)雜的分子機(jī)制尚未完全闡明,因此探索肺癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制尤其重要。研究發(fā)現(xiàn)許多RNA結(jié)合蛋白與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系,本文旨在研究RNA結(jié)合蛋白ASS1和CSRP1對人肺癌細(xì)胞增殖和遷移侵襲潛能的影響及其可能作用機(jī)制。我們分別構(gòu)建了穩(wěn)定過表達(dá)或穩(wěn)定敲減ASS1和CSRP1肺癌穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。首先通過實時熒光定量PCR及蛋白質(zhì)印記法檢測ASS1和CSRP1 mRNA及蛋白在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平。然后通過CCK-8法、Transwell遷移侵襲實驗和細(xì)胞劃痕實驗,我們發(fā)現(xiàn)ASS1過表達(dá)可抑制肺癌細(xì)胞的遷移侵襲能力而對肺癌細(xì)胞的增殖能力無明顯影響;CSRP1過表達(dá)可促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖和遷移侵襲能力。在各自的分子機(jī)制研究方面,我們發(fā)現(xiàn)ASS1可以參與MAPK通路的調(diào)控;CSRP1參與調(diào)控p-FAK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。此外通過蛋白質(zhì)免疫共沉淀實驗,我們發(fā)現(xiàn)ASS1可與促癌基因CPS1結(jié)合,并調(diào)控后者表達(dá)水平。綜上所述,我們揭示了RNA結(jié)合蛋白ASS1以及CSRP1在肺癌增殖和侵襲遷移中的作用以及可能的分子機(jī)制。這些發(fā)現(xiàn)為尋找肺癌新的治療靶點提供了新的線索。
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R734.2
【圖文】：

25 ng/ml，100ng/ml，200ng/ml，400ng/ml，培養(yǎng) 96h 后，CCK8 法檢測細(xì)胞活力。統(tǒng)計學(xué)方法采用 SPSS 13.0 和 GraphPad Prism 5 軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。組間差異分析采用 t 檢驗（two-tailed，P <0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義）。2 結(jié)果2.1 肺癌 低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系 mRNA 表達(dá)譜芯 結(jié)果的驗證在我們實驗室的前期工作中，我們對 SPC-A-1 和 SPC-A-1sci 細(xì)胞進(jìn)行了兩次 mRNA 表達(dá)譜芯片分析，我們從中挑選了 10 個轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因進(jìn)行 mRNA水平驗證，圖 1-1 顯示驗證結(jié)果基本與芯片結(jié)果一致，由此證實了我們芯片結(jié)果的可靠性。

第一部分 ASS1 抑制肺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力及cells compared with the SPC-A-1 cells. ASS1 = argininosuccinate synthase 12.2 3 個候選基因在肺癌細(xì)胞系中的功能驗證接下來我們挑選了 ASS1， ALDH2，MSLN 這三個基因進(jìn)行初步實驗。首先我們在 mRNA 表達(dá)水平較高的 SPC-A-1 細(xì)胞中通過 si-RN染的方法，敲低這三個基因的表達(dá)水平，mRNA 表達(dá)水平的質(zhì)控如圖 1-2轉(zhuǎn)染有效。Transwell 遷移實驗（圖 1-2B）顯示敲減 ASS1 之后，SPC-的遷移潛能明顯增強(qiáng)，而敲減 ALDH2 和 MSLN 之后，SPC-A-1 細(xì)胞的并未發(fā)生明顯改變。A

after transfecting with si-ASS1/si-ALDH2/ si-MSLN or si-NC in SPC-A-1 cell line, β-actin was used as the loading control. (B)The migration ability of SPC-A-1 cells wasdetected by Transwell assays. The left panels show photos of representative fields(magnification: 100×) of migration cells and the right panel shows histograms of theresults. Student’s t-test was used for Statistical analysis.2.3 重組慢病毒感染后 ASS1 的過表達(dá)和干擾效果檢測根據(jù) 2.1.1 qRT-PCR 結(jié)果顯示，ASS1 在 SPC-A-1sci 中表達(dá)水平較低，而在SPC-A-1 中表達(dá)水平較高，因此我們選擇在 SPC-1-1sci 中穩(wěn)定過表達(dá) ASS1，并在 SPC-A-1 中穩(wěn)定干擾 ASS1.qRT-PCR 實驗和 WesternBlot 實驗分別檢測過表達(dá)效率以及干擾效率檢測，結(jié)果如圖 1-3 所示。A B

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本文編號：2775259