【摘要】：研究目的通過構(gòu)建pGenesil-3.1-HBx-shRNA載體和pHBLV-h-CCL20載體,轉(zhuǎn)染入HepG2.2.15細(xì)胞,研究HBx沉默和h-CCL20過表達(dá)對HepG2.2.15細(xì)胞生長的影響,以期闡明兩種基因參與肝臟惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。研究方法(1)構(gòu)建pGenesil-3.1-HBx-shRNA載體,通過電穿孔法轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞。(2)通過實時熒光定量PCR檢測HBx、h-CCL20基因表達(dá)量差異;CCK8法檢測細(xì)胞增殖活力;對各組細(xì)胞上清液中HBsAg和HBeAg進(jìn)行檢測;運用流式術(shù)對HepG2.2.15細(xì)胞的凋亡進(jìn)行檢測。(3)構(gòu)建pHBLV-h-CCL20載體并轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞,在熒光顯微鏡下觀察到有明顯的綠色熒光,表明pHBLV-h-CCL20載體轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞成功。研究結(jié)果(1)成功構(gòu)建pGenesil-3.1-HBx-shRNA載體和pHBLV-h-CCL20載體,且在HepG2.2.15細(xì)胞中能夠成功的表達(dá)。(2)從實時熒光定量PCR結(jié)果知,已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染了pGenesil-3.1-HBx-shRNA載體的HepG2.2.15細(xì)胞HBx基因的表達(dá)與轉(zhuǎn)染空載體的HepG2.2.15細(xì)胞相比下降了28%,與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),從而說明shRNA對HBx基因的表達(dá)起到了抑制的作用。(3)用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況表明,HepG2.2.15細(xì)胞的增殖水平明顯的受shRNA的抑制,細(xì)胞增殖水平下降了47%,與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(4)轉(zhuǎn)染pGenesil-3.1-HBx-shRNA載體后,HepG2.2.15細(xì)胞上清液中HBsAg和HBeAg的表達(dá)量下降明顯,HepG2.2.15細(xì)胞的凋亡明顯增加,與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),因此表明HBx基因在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮作用。(5)pHBLV-h-CCL20載體在HepG2.2.15細(xì)胞中h-CCL20基因過表達(dá),h-CCL20基因過表達(dá)在HepG2.2.15細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮促進(jìn)作用。結(jié)論(1)利用RNAi技術(shù),應(yīng)用電穿孔法轉(zhuǎn)染細(xì)胞,在HepG2.2.15細(xì)胞中,抑制HBx基因的表達(dá),使上清液中HBsAg和HBeAg的表達(dá)量下降;對HepG2.2.15細(xì)胞的增殖起到抑制作用,促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。(2)pHBLV-h-CCL20載體在HepG2.2.15細(xì)胞中h-CCL20基因過表達(dá),h-CCL20基因過表達(dá)在HepG2.2.15細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮促進(jìn)作用,為h-CCL20基因的研究提供理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：海南醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.7
【圖文】：

海南醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文⑤把適量培養(yǎng)基加進(jìn)去，然后輕輕小心充分吹打散細(xì)胞，加入適量細(xì)胞凍存液，混勻。隨后分裝到凍存管中，并且標(biāo)好相應(yīng)的信息。將凍存管放于冰箱中（4°C2 小時，-20°C 2 小時，-80°C 24 小時），最后放到液氮長期保存。1.2.2 構(gòu)建 pGenesil-3.1-HBx-shRNA 重組表達(dá)載體（1）設(shè)計引物及連接根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[38]引物結(jié)構(gòu)，設(shè)計序列如下。引物結(jié)構(gòu)：BamHI +Sense+Loop+Antisense+終止信號+ SalI + HindIII。

功構(gòu)建 pGenesil-3.1-HBx-shRNA 重組表達(dá)載體得到線性化的 pGenesil-3.1 質(zhì)粒根據(jù) pGenesil-3.1 質(zhì)粒載體圖譜可知，在 U6 啟動子下存在兩個酶切是 Hind III 和 BamH I。為了得到所要的線性化 pGenesil-3.1 質(zhì)粒，可 III 和 BamH I 酶切，但是查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)這兩種內(nèi)切酶所用的反，Hind III 酶切體系為（10×M Buffer 2μL +pGenesil-3.1 質(zhì)粒 17μL+），先用 Hind III 進(jìn)行酶切，然后回收，接著再用 BamH I 進(jìn)行酶切體系為（10×K Buffer 2μL +pGenesil-3.1 質(zhì)粒 17μL+BamH I 1μL產(chǎn)物就是所要的線性化 pGenesil-3.1 質(zhì)粒。①據(jù)反應(yīng)條件，首先用 Hind III 酶切，酶切體系為：10×M Buenesil-3.1 質(zhì)粒 17μL+Hind III 1μL。所得結(jié)果如下圖 1 所示，其5000；A、C：為經(jīng) Hind III 單酶切的質(zhì)粒；B：為未酶切質(zhì)粒。

I 酶切體系為（10×K Buffer 2μL +pGenesil-3.1 質(zhì)粒 17μL+BamH 回收產(chǎn)物就是所要的線性化 pGenesil-3.1 質(zhì)粒。①據(jù)反應(yīng)條件，首先用 Hind III 酶切，酶切體系為：10×L+pGenesil-3.1 質(zhì)粒 17μL+Hind III 1μL。所得結(jié)果如下圖 1 所示DL 15000；A、C：為經(jīng) Hind III 單酶切的質(zhì)粒；B：為未酶切質(zhì)粒圖 1 pGenesil-3.1 質(zhì)粒 Hind III 酶切②將 pGenesil-3.1 質(zhì)粒 Hind III 酶切后，把大片段回收，然后是對的。所得結(jié)果如下圖 2 所示，其中 M1：10μL DL 15000；A產(chǎn)物；M2：15μL DL 15000。

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本文編號：2773305